【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白纯化，特别是涉及一种无标签α-突触核蛋白的纯化方法。
技术介绍
1、α-突触核蛋白(α-synuclein蛋白)是细胞功能中不可或缺的蛋白质，其异常聚集与帕金森病等神经退行性疾病密切相关。在医学研究中，检测α-突触核蛋白对于帕金森病、路易体痴呆以及其他突触核蛋白病具有重要意义。这些疾病均涉及α-突触核蛋白的病理性聚集，而rt-quic(real-time quaking-induced conversion，实时震荡诱导转化)作为一种生化检测技术，能够通过在体外模拟蛋白质聚集过程，检测与疾病相关的病理性蛋白聚集体。rt-quic技术可以在脑脊液、皮肤、血液等生物样本中快速且高灵敏度地识别这些异常折叠的蛋白质，有助于相关疾病的早期诊断和发病机制研究。rt-quic具有高度的敏感性，主要通过体外诱导种子介导的α-突触核蛋白单体依赖性扩增，结合实时荧光定量技术，来判断样本中是否存在病理性聚集体。为了确保检测的准确性，获得高纯度和高产量的单体至关重要。
2、在制备α-突触核蛋白单体的过程中，确保纯化是至关重要的。因为不充分的纯化会对实验结果产生负面影响，特别是在如rt-quic等高度敏感的检测技术中。蛋白质样品中可能存在的杂质蛋白可能会与α-突触核蛋白相互作用，诱导非特异性聚集，干扰实验结果。未充分纯化的α-突触核蛋白可能还混有细胞溶解液中的其他成分，如核酸、脂质或小分子，这些成分可能影响蛋白质的正常功能，降低蛋白质的聚集诱导能力，进而降低检测的敏感度。
3、目前，常用的蛋白质纯化方法是利用标签
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种无标签α-突触核蛋白的纯化方法，以解决上述现有技术存在的问题。本专利技术提供的一种无标签α-突触核蛋白的纯化方法是一种更为高效、经济且能够保持蛋白质功能的纯化方法，该方法能够提升α-突触核蛋白单体制备的整体效果和实验准确性。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种无标签α-突触核蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
4、(1)构建含有α-突触核基因的重组表达载体；
5、(2)将所述重组表达载体转化至宿主菌，诱导表达，离心后收集菌体；
6、(3)对所述菌体依次进行超声粉碎、煮沸和离心，收集离心后的上清液；
7、(4)对所述上清液依次进行硫酸铵沉淀、离心、酸沉淀和碱中和，得到待纯化蛋白液；所述硫酸铵沉淀包括一次沉淀和二次沉淀；
8、(5)对所述待纯化蛋白液进行阴离子交换层析、超滤过滤和浓缩，得到所述无标签α-突触核蛋白；所述超滤过滤包括第一超滤过滤和第二超滤过滤。
9、优选的，在步骤(4)中，所述一次沉淀包括将所述上清液与60％w/v(质量体积分数)硫酸铵溶液混合后，依次进行静置和离心，收集上清液，得到蛋白溶液的步骤；
10、所述二次沉淀包括将所述蛋白溶液与60％w/v硫酸铵溶液混合后进行离心，得到蛋白沉淀的步骤。
11、优选的，所述上清液与60％w/v硫酸铵溶液混合后所得混合液中硫酸铵的质量体积分数为18％；
12、所述蛋白溶液60％w/v硫酸铵溶液混合后所得混合液中硫酸铵的质量体积分数为27％。
13、优选的，在步骤(5)中，所述第一超滤过滤包括将所述阴离子交换层析所得靶蛋白加入到100kd的超滤管后进行离心和过滤，收集过滤液，得到第一滤过液的步骤；
14、所述第二超滤过滤包括将所述第一滤过液加入到50kda的超滤管后进行离心和过滤，收集过滤液，得到所述第二滤过液的步骤。
15、优选的，在步骤(4)中，所述酸沉淀包括将所述离心所得上清液与盐酸混合后离心，并收集离心所得上清液的步骤。
16、优选的，在步骤(5)中，所述浓缩包括将所述第二滤过液加入到3kda的超滤管后进行离心和过滤，得到所述无标签α-突触核蛋白的步骤。
17、优选的，在步骤(3)中，所述超声粉碎的条件参数为：60％强度；开10s、关10s的间隔超声，持续操作30min。
18、优选的，在步骤(3)中，所述煮沸的温度为100℃，时间为10min。
19、优选的，在步骤(3)中，所述离心的条件参数为：4℃、20000g离心30min。
20、优选的，在步骤(1)中，所述重组表达载体的基础载体为pet-28a(+)。
21、本专利技术公开了以下技术效果：
22、1、高纯度和高产量
23、本专利技术采用不依赖于标签的纯化方法，克服了传统亲和层析中标签对纯化效果的限制。通过优化纯化步骤，可以有效提高α-突触核蛋白的纯度和产量。这对于后续的实验及应用至关重要，因为高纯度的蛋白质能够减少非特异性聚集的风险，提高检测的灵敏度和准确性。由此可见，本专利技术提供的不依赖标签的高效纯化方法，能够克服亲和层析法中标签蛋白分离量有限、成本高的问题，同时大幅提高α-突触核蛋白的产量。
24、2、避免标签干扰
25、许多常规的纯化方法依赖于添加标签(如his或gst)，这可能导致目标蛋白质构象的改变，从而影响其生物活性和实验结果的准确性。本专利技术提供的纯化技术不需要添加标签，能够在纯化过程中保持蛋白质的原有构象和生物学功能。该方法不仅确保α-突触核蛋白在实验中的活性保持不变，还能保证实验结果的可靠性与一致性。这种保持生物活性的特性对于后续的生物学研究和应用尤为重要。
26、3、经济高效
27、传统的蛋白质纯化方法，如亲和层析和分子筛层析，往往成本高且耗时长。本专利技术开发的纯化技术降低了材料成本和操作时间，适合大规模生产，能有效满足实验室和工业应用的需求。这种经济效益使得该技术在实际应用中更加具备可行性。
28、4、减少杂质影响
29、在纯化过程中，未经充分纯化的α-突触核蛋白可能会携带一些与其相互作用的杂质蛋白，这些杂质容易诱发非特异性的聚集，杂质蛋白的存在可能会干扰实验结果，影响实验的精确性，尤其是在敏感检测技术如rt-quic中。本专利技术利用α-突触核蛋白的理化特性进行杂质去除，确保了目标蛋白的高纯度而不是依赖传统的分子量差异进行分子筛层析。这一过程显著降低了非特异性聚集的发生率，增强了实验的可靠性。而且这种方法确保了α-突触核蛋白单体的高纯度，为后续实验提供更加准确可靠的基础。
30、5本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种无标签α-突触核蛋白的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述一次沉淀包括将所述上清液与60％w/v硫酸铵溶液混合后，依次进行静置和离心，收集上清液，得到蛋白溶液的步骤；
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述上清液与60％w/v硫酸铵溶液混合后所得混合液中硫酸铵的质量体积分数为18％；
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述第一超滤过滤包括将所述阴离子交换层析所得靶蛋白加入到100kd的超滤管后进行离心和过滤，收集过滤液，得到第一滤过液的步骤；
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述酸沉淀包括将所述离心所得上清液与盐酸混合后离心，并收集离心所得上清液的步骤。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述浓缩包括将所述第二滤过液加入到3kDa的超滤管后进行离心和浓缩，得到所述无标签α-突触核蛋白的步骤。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述煮沸的温度为100℃，时间为10min。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述离心的条件参数为：4℃、20000g离心30min。
10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述重组表达载体的基础载体为pET-28a(+)。
...【技术特征摘要】
1.一种无标签α-突触核蛋白的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述一次沉淀包括将所述上清液与60％w/v硫酸铵溶液混合后，依次进行静置和离心，收集上清液，得到蛋白溶液的步骤；
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述上清液与60％w/v硫酸铵溶液混合后所得混合液中硫酸铵的质量体积分数为18％；
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述第一超滤过滤包括将所述阴离子交换层析所得靶蛋白加入到100kd的超滤管后进行离心和过滤，收集过滤液，得到第一滤过液的步骤；
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述酸沉淀包括将所述离心所得上清液与盐酸混合后离心，并收集离心所得...
【专利技术属性】
技术研发人员：毛珩旭，况耀鋆，戴玮，林浩，甘婷婷，王嘉琪，李冲，董晓莉，杨新玲，徐评议，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院广州呼吸中心，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。