【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于但不限于基因合成，尤其涉及一种红细胞膜包被的框架核酸纳米凝胶制备方法。
技术介绍
1、纳米凝胶作为一种多孔、可调控结构的材料，在药物输送和生物医药领域具有广泛应用。传统的纳米凝胶通常由聚合物或无机材料构成，具有良好的生物相容性和药物载体功能。核酸药物，如小干扰rna(sirna)和小分子rna(mirna)等，由于其能够干预基因表达而被广泛研究并应用于疾病治疗领域。然而，由于其生理稳定性、细胞靶向及胞内释放等问题，核酸药物的输送依然面临巨大挑战。目前，用于基因递送的病毒或非病毒载体取得巨大进步，但仍然存在重大挑战。例如，病毒载体虽能有效地转染靶基因细胞，但其免疫原性和致突变性严重阻碍了其应用。非病毒载体如胶束、脂质体和无机纳米颗粒等虽均能在体内外递送核酸药物，但仍存在效率和安全性问题。同时，基因沉默效果与载体的阳离子性质密切相关，目前的困境是载体的阳离子电荷越高，越能有效地压缩核酸药物，进而有效沉默靶基因的表达，但此时阳离子材料毒性增强，产生严重的副作用。此外，阳离子纳米粒与血浆中带负电的蛋白质相互作用强烈，导致纳米载体不稳定，在循环过程中快速清除，降低核酸药物的治疗效果。因此亟需打破阳离子载体递送模式，寻核酸药物递送新策略成为实现其安全有效递送的发展前景。
2、鉴于上述分析，现有技术存在的急需解决的技术问题为：阳离子纳米粒与血浆中带负电的蛋白质相互作用强烈，导致纳米载体不稳定，在循环过程中快速清除，降低核酸药物的治疗效果。
技术实现思路
1、针对现有技术
2、本专利技术是这样实现的，一种红细胞膜包被的框架核酸纳米凝胶制备方法，包括：
3、s1，将等摩尔量的寡核苷酸在tm缓冲液中混合；
4、s2，将混合物溶液在95℃下加热10-20min，然后快速转移至4℃冷却得dna四面体框架核酸纳米结构，之后置于4℃环境下储存；
5、s3，制备作为交联剂的具有粘性末端的sirna(本专利技术以sitox为例)；
6、s4，将sirna和tdn按摩尔比1：2混合，在37℃下剧烈振荡3h，得到ng并置于4℃下保存；
7、s5，取小鼠全血在4℃以下3000rpm离心5分钟，去除血浆和血沉棕黄层；
8、s6，收集红细胞沉淀物，在冰冷的1x磷酸盐缓冲液中洗涤3次，并重悬于10倍体积的0.25x pbs中，然后将溶液置于4℃下溶血破膜3-4小时；
9、s7，12000rpm离心5min用以去除释放的血红蛋白，下层沉淀重悬于低渗溶液中，多次洗涤至上清液无色，获得红细胞膜(rbcm)；
10、s8，重新将rbcm分散于1x pbs溶液中，并水浴超声5分钟，使用avanti小型挤出机将上述rbcm分别通过400nm和200nm聚碳酸酯多孔膜挤出，制备均一rbcm囊泡；
11、s9，将所得rbcm囊泡与ng混合，并使用avanti小型挤出机通过100nm聚碳酸酯多孔膜共挤出14次，得到红细胞膜包被的载药核酸纳米凝胶。
12、制备作为交联剂的具有粘性末端的sirna具体步骤如为：将正义sitox和反义sitox分别溶解在depc水中，以等摩尔比混合，将混合后的液体在pcr仪中进行梯度退火至室温，并将组装的sirna在-20℃下储存。
13、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本专利技术所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
14、第一、本专利技术的递送载体结合了红细胞膜的生物特性、框架核酸及纳米凝胶的结构优势，成功以sirna作为交联链通过碱基互补配对连接四面体框架核酸实现了基于框架核酸的纳米凝胶的构筑，构建集基因-免疫治疗为一体的仿生型框架核酸纳米凝胶载体，旨在克服传统核酸药物输送系统的局限性、提高核酸材料及核酸药物的稳定性，在rna干扰技术及精准医疗领域具有广泛应用前景。
15、第二，作为本专利技术的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
16、(1)本专利技术的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
17、该专利技术有助于面向药物可控递送载体的产业化推广，有望成为实现核酸药物递送的通用策略，对提高载体体内长循环、药物生物利用率、及核酸药物递送具有重要意义，将极大地拓宽药物可控递送及rna干扰技术的应用领域于发展。同时，该专利技术将积极推动产学研合作，促进科研成果的转化和应用，推动新药研发与临床实验的积极探索，带来巨大的经济效益。
18、(2)本专利技术的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
19、sirna的生理稳定性、纳米复合物的药效学性质以及载体材料的长期生物安全性使rna干扰疗法的临床应用受到极大阻碍。目前，用于基因递送的病毒或非病毒载体取得巨大进步，但仍然存在致突变性、转染效率和安全性问题等重大挑战。由阳离子聚合物和脂质组成的胶束和脂质体是最常用的非病毒载体，可通过静电作用有效地压缩sirna并将其递送到靶细胞。然而，基因沉默效果与载体的阳离子性质密切相关，通常存在的困境是载体的阳离子电荷越高，越能有效地压缩sirna，进而有效沉默靶基因的表达，但此时阳离子材料的毒性增强，会产生严重的副作用。同时，阳离子纳米粒与血浆中带负电的蛋白质相互作用强烈，导致纳米载体不稳定，在循环过程中快速清除，降低rna干扰技术的治疗效果。因此，打破阳离子载体递送模式，寻找sirna递送新策略迫在眉睫。
20、(3)本专利技术的技术方案克服了技术偏见：
21、本专利技术通过引入利用dna四面体框架核酸结构与sirna结合形成的纳米凝胶，突破了传统阳离子载体递送核酸药物模式的技术偏见。传统技术多通过阳离子性脂质体或聚合物载体，依赖静电相互作用递送核酸药物，但多存在递送效率低、细胞毒性高及免疫反应等问题限制其应用。与传统阳离子载体依赖于电荷相互作用不同，带负电荷的dna纳米结构依赖于共价结合或分子识别来压缩功能核酸并形成递送复合物。本专利技术的dna四面体框架核酸结构提供了一个新颖的自组装平台，具有优良的生物相容性和高效的核酸递送能力，从而打破了传统利用阳离子相关载体递送核酸药物的模式，实现基于核酸结构递送核酸药物的新策略，同时实现了更为稳定和高效的核酸药物递送。
22、第三，本专利技术的技术方案通过红细胞膜包被的框架核酸纳米凝胶(m@ng)的制备方法，解决了现有技术中核酸药物稳定性差、体内循环时间短、易被酶降解以及靶向性不足等问题，并取得了显著的技术进步，主要体现在以下几个方面：
23、1.提高了核酸药物的稳定性和生物兼容性
24、传统的核酸药物在体内容易受到酶的降解，导致其稳定性和药效显著降低。本专利技术通过双重保护屏障的设计，利用框架本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种红细胞膜包被的框架核酸纳米凝胶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的红细胞膜包被的核酸纳米凝胶制备方法，其特征在于，所述S2步骤中的四面体框架核酸纳米结构是通过将寡核苷酸在TM缓冲液中混合加热、快速冷却及4℃储存过程中形成的。
3.根据权利要求1所述的红细胞膜包被的核酸纳米凝胶制备方法，其特征在于，所述S3步骤中用于形成NG的siRNA为带有粘性末端的siTOX，通过正义链与反义链的梯度退火至室温形成，并储存于-20℃。
4.根据权利要求1所述的红细胞膜包被的核酸纳米凝胶制备方法，其特征在于，所述S5步骤中的RBCm囊泡通过Avanti小型挤出机，分别通过400nm和200nm聚碳酸酯多孔膜挤出后，最终通过100nm聚碳酸酯多孔膜共挤出14次形成均一的M@NG结构。
5.一种红细胞膜包被的载药核酸纳米凝胶，其特征在于，该纳米凝胶由框架核酸纳米凝胶NG与红细胞膜RBCm包被而成，其中NG通过TDN和siRNA的碱基互补配对及交联形成，RBCm为NG提供生物相容性和免疫逃逸性。
6.根
...【技术特征摘要】
1.一种红细胞膜包被的框架核酸纳米凝胶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的红细胞膜包被的核酸纳米凝胶制备方法，其特征在于，所述s2步骤中的四面体框架核酸纳米结构是通过将寡核苷酸在tm缓冲液中混合加热、快速冷却及4℃储存过程中形成的。
3.根据权利要求1所述的红细胞膜包被的核酸纳米凝胶制备方法，其特征在于，所述s3步骤中用于形成ng的sirna为带有粘性末端的sitox，通过正义链与反义链的梯度退火至室温形成，并储存于-20℃。
4.根据权利要求1所述的红细胞膜包被的核酸纳米凝胶制备方法，其特征在于，所述s5步骤中的r...
【专利技术属性】
技术研发人员：燕建芹，赵子健，刘朝龙，王凌阳，魏登帅，孙勇，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：
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