【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及制备标准化表达盒的方法。本专利技术还涉及用于在宿主细胞中体内重组此类标准化表达盒的方法。
技术介绍
1、多特异性抗体和抗体样构建体具备几种对开发治疗分子的人有吸引力的特征。同时靶向多个靶标的多特异性抗体，例如双特异性和三特异性抗体的临床潜力示出用于靶向复杂疾病的广阔前景。然而，由于在转染到单个细胞后，由多条多肽链构成的新的四级结构的配对/折叠(特别是当配对抗体重链和轻链时)，那些分子的产生存在巨大挑战。对多个多肽链分子的有效和适当组装至关重要的是不同链在细胞内以适当比率表达。
2、本专利技术使用模块化载体(modvec)系统来解决这个问题，以快速构建用于重组蛋白生产的不同表达载体和载体文库。modvec使得能够快速且高通量地构建简单和复杂的载体设计两者，使得能够优化针对单个分子、针对特定大分子形式和/或针对不同表达宿主的表达载体。
3、产生多链分子的一个主要挑战是由不平衡的链表达比率引起的不同产物质量，并且该比率是分子特异性的以及对包括表达载体元件的细胞-宿主发育过程具有特异性。目前，不存在以高通量确定最佳分子特异性链表达比率的方法。modvec载体文库提供了快速确定单个多链分子的最佳表达构型的平台。modvec可以用于更普遍的应用中，以组装复杂的大dna分子，用于除了用于抗体治疗的表达载体之外的目的。
技术实现思路
1、在一个方面，本专利技术涉及一种用于表达包含至少两条不同多肽链的多链蛋白的方法，该方法包括
2、a.提供编码该至少
3、b.提供两组或更多组元件序列；其中每组元件序列一起包含至少一个功能性表达盒，
4、其中每个元件序列在5’和3’两侧均侧接iis型限制性内切核酸酶切割位点，随后是其识别位点，
5、其中选择这些iis型限制性内切核酸酶识别位点和切割位点，使得这些组的元件序列可以组装成功能性表达盒；
6、c.提供至少一种骨架进入载体，其中该骨架进入载体包含质粒，该质粒包含至少一个iis型限制性内切核酸酶切割位点，随后是其识别位点，以及用于将该载体维持在细菌细胞中的序列；
7、d.使用基于使用iis型限制性内切酶消化以及经由这些切割位点和突出端的连接的方法，将编码该至少两种不同多肽的多核苷酸序列与该两组或更多组元件序列组装以在该骨架进入载体中产生功能性表达盒，从而产生包含能够表达该至少两条不同多肽链的至少两个功能性表达盒的连接载体；
8、e.用连接载体转染哺乳动物细胞；
9、f.比较所产生的优选产物的水平和该至少两种多肽中每一种的杂质的水平；以及
10、g.鉴定这两种多肽对于这些转染的哺乳动物细胞的最佳表达比率并且鉴定具有该至少两条多肽链的最佳表达比率的转染的哺乳动物细胞。
11、在一个实施例中，该方法进一步包括：
12、h.鉴定提供该至少两条多肽链的最佳表达比率的载体元件的排列。
13、在一个方面，本专利技术涉及一种载体，该载体包含提供该至少两条多肽链的最佳表达比率的载体元件的排列。
14、在一个实施例中，元件序列包含至少两个启动子序列和至少两个多聚腺苷酸(polya)序列。
15、在一个实施例中，所产生的优选产物的水平是通过选自下组的一种方法来测量的，该组由以下组成：阳离子交换色谱(还原或非还原)、质谱法、任何其他色谱分离、或其组合。
16、在一个实施例中，iis型限制性内切核酸酶切割位点中没有一个在被iis型限制性内切核酸酶切割后产生5’的选自由gtaa、tcca和caca组成的组的四个核苷酸的突出端。
17、在一个实施例中，iis型限制性内切核酸酶切割位点选自由以下组成的组：
18、aggt、agta、atca、cagt、ccat、gaat、gagg、ggca、ggtc、tagc、tctt、ggag、和ccac。
19、在一个实施例中，哺乳动物细胞选自由以下组成的组：cho细胞、chok1细胞、dxb-11、dg-44、cos-7、hek293、bhk、tm4、cv1、vero-76、hela、mdck、brl 3a、w138、hep g2、mmt060562、tri细胞、mrc 5细胞、fs4细胞、和哺乳动物骨髓瘤细胞。
20、在一个实施例中，该至少两种多肽的最佳表达比率选自由以下组成的组：1:1、1:2、和1:3。
21、在一个实施例中，多链蛋白包含第一抗体重链、第一抗体轻链、第二抗体重链、和第二抗体轻链，其中该第一抗体重链与该第一抗体轻链缔合以结合第一抗原或表位，并且该第二抗体重链与该第二抗体轻链缔合以结合第二抗原或表位，其中该第一抗体重链、该第一抗体轻链、该第二抗体重链、和该第二抗体轻链的最佳表达比率是1:1:1:1。
22、在一个实施例中，多链蛋白包含第一抗体重链、第二抗体重链、和共同抗体轻链，其中该第一抗体重链与该共同抗体轻链缔合以结合第一抗原或表位，并且该第二抗体重链与该共同抗体轻链缔合以结合第二抗原或表位，其中该第一抗体重链、该第二抗体重链、和该共同抗体轻链的最佳表达比率是1:1:2。
23、在一个实施例中，多链蛋白包含抗体重链、第一抗体轻链、经修饰的抗体重链、和第二抗体轻链，
24、其中该经修饰的抗体重链在n-末端至c-末端包含选自下组的以下结构之一：
25、vh-ch1-结合结构域(bd)-铰链-ch2-ch3；
26、bd-vh-ch1-铰链-ch2-ch3；以及
27、vh-ch1-铰链-ch2-ch3-bd；
28、其中该bd选自单链fv(scfv)或单链fab(scfab)；
29、其中该抗体重链与该第一抗体轻链缔合以结合第一抗原或表位，并且该经修饰的抗体重链的vh与该第二抗体轻链缔合以结合第二抗原或表位，其中该bd结合第三抗原或表位，并且
30、其中该第一抗体重链、该第一轻链、该经修饰的抗体重链、和该第二抗体轻链的最佳表达比率是1:1:1:1。
31、在一个实施例中，多链蛋白包含抗体重链、经修饰的抗体重链、和共同抗体轻链，
32、其中该经修饰的抗体重链在n-末端至c-末端包含选自下组的以下结构之一：
33、vh-ch1-结合结构域(bd)-铰链-ch2-ch3；
34、bd-vh-ch1-铰链-ch2-ch3；以及
35、vh-ch1-铰链-ch2-ch3-bd；
36、其中该bd选自单链fv(scfv)或单链fab(scfab)；
37、其中该抗体重链与该共同抗体轻链缔合以结合第一抗原或表位，并且该经修饰的抗体重链的vh与该共同抗体轻链缔合以结合该第一抗原或表位，其中该bd结合第二抗原或表位，并且<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于表达包含至少两条不同多肽链的多链蛋白的方法，该方法包括
2.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括：
3.根据任一前述权利要求所述的方法，其中这些元件序列选自由以下组成的组：控制序列、绝缘子序列、条形码DNA序列、引物序列、启动子序列、多聚腺苷酸序列、和IRES序列，以及哺乳动物可选择标记序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其中这些元件序列包含至少两个启动子序列和至少两个多聚腺苷酸序列。
5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所产生的优选产物的水平是通过选自下组的方法来测量的，该组由以下组成：阳离子交换色谱(还原或非还原)、质谱法、或其组合。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中这些IIS型限制性内切核酸酶切割位点中没有一个在被这些IIS型限制性内切核酸酶切割后产生5’的选自由GTAA、TCCA和CACA组成的组的四个核苷酸的突出端。
7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中这些IIS型限制性内切核酸酶切割位点选自由以下组成的组：
8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中这
9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中该至少两种多肽的最佳表达比率选自由以下组成的组：1:1、1:2、和1:3。
10.根据权利要求1所述的方法，其中该多链蛋白包含第一抗体重链、第一抗体轻链、第二抗体重链、和第二抗体轻链，其中该第一抗体重链与该第一抗体轻链缔合以结合第一抗原或表位，并且该第二抗体重链与该第二抗体轻链缔合以结合第二抗原或表位，其中该第一抗体重链、该第一抗体轻链、该第二抗体重链、和该第二抗体轻链的最佳表达比率是1:1:1:1。
11.根据权利要求1所述的方法，其中该多链蛋白包含第一抗体重链、第二抗体重链、和共同抗体轻链，其中该第一抗体重链与该共同抗体轻链缔合以结合第一抗原或表位，并且该第二抗体重链与该共同抗体轻链缔合以结合第二抗原或表位，其中该第一抗体重链、该第二抗体重链、和该共同抗体轻链的最佳表达比率是1:1:2。
12.根据权利要求1所述的方法，其中该多链蛋白包含抗体重链、第一抗体轻链、经修饰的抗体重链、和第二抗体轻链，
13.根据权利要求1所述的方法，其中该多链蛋白包含抗体重链、经修饰的抗体重链、和共同抗体轻链，
14.一种载体，其包含根据权利要求2，步骤h的载体元件的排列。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于表达包含至少两条不同多肽链的多链蛋白的方法，该方法包括
2.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括：
3.根据任一前述权利要求所述的方法，其中这些元件序列选自由以下组成的组：控制序列、绝缘子序列、条形码dna序列、引物序列、启动子序列、多聚腺苷酸序列、和ires序列，以及哺乳动物可选择标记序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其中这些元件序列包含至少两个启动子序列和至少两个多聚腺苷酸序列。
5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所产生的优选产物的水平是通过选自下组的方法来测量的，该组由以下组成：阳离子交换色谱(还原或非还原)、质谱法、或其组合。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中这些iis型限制性内切核酸酶切割位点中没有一个在被这些iis型限制性内切核酸酶切割后产生5’的选自由gtaa、tcca和caca组成的组的四个核苷酸的突出端。
7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中这些iis型限制性内切核酸酶切割位点选自由以下组成的组：
8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中这些哺乳动物细胞选自由以下组成的组：cho细胞、chok1细胞、dxb-11、dg-44、cos-7、hek293、bhk、tm4、cv1、vero-76、hela、mdck、brl3a、w13...
【专利技术属性】
技术研发人员：F·陈，M·莫克，E·J·别洛乌斯基，
申请(专利权)人：安进公司，
类型：发明
国别省市：
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