本发明专利技术属于生物化学技术领域，具体涉及一种苯海索人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。苯海索人工半抗原的分子结构式如式(Ⅰ)，苯海索人工抗原的分子结构式如式(Ⅱ)。苯海索人工抗原可应用于抗苯海索抗体制备领域中。本发明专利技术的苯海索人工半抗原最大程度地保留了苯海索的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的苯海索人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗苯海索抗体，经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价高达1:256000，可用于对苯海索进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学，具体涉及一种苯海索人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。
技术介绍
1、苯海索[trihexyphenidyl]又名三已芬迪、安坦，是一种比较常见的抗胆碱类药物。苯海索能阻断胆碱，在中枢神经系统发挥作用，起到维持中枢神经系统平衡，抑制肌肉强直、震颤的作用。医学上主要用于改善帕金森病、帕金森综合征引起的不适症状。也可用于药物引起的锥体外系疾患。
2、随着苯海索这种药物的普及，出现苯海索使用过量、滥用的情况。苯海索过量、滥用会出现一系列不良反应。过量服用的症状包括瞳孔扩大、粘膜干燥、脸部发红、肠道和膀胱无力状态以及高剂量时的高温。苯海索会因其对中枢神经系统的影响导致情绪激动、精神错乱和幻觉。未经治疗的过量服用可能会导致死亡，尤其是儿童，出现呼吸抑制和心脏骤停可能是死亡的前兆。
3、过量服用苯海索的患者还可能会出现口干、无汗、瞳孔扩大、恶心、呕吐、心率异常、高温发热、肠胃蠕动减弱、排尿踌躇或潴留、皮疹、意识模糊、烦躁不安、激动、协调性差、偏执、精神病、谵妄、幻觉、昏迷、呼吸衰竭、循环衰竭和死亡。
4、目前，对苯海索的检测主要依靠液相色谱-质谱联用法(lc-ms)、气相色谱-质谱联用法(gc-ms)、核磁共振氢谱(h nmr)、核磁共振碳谱(13c nmr)、核磁共振氟谱(19f nmr)、红外光谱(ir)、薄层色谱法(tlc)等，但是都存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，难以达到现代检测对快速、准确的要求，因此建立快速、灵敏、准确的检测技术是很有必要的。</p>5、免疫层析试纸快速检测技术则可以弥补以上所有缺点，该技术具有特异性强、灵敏度高、简便、经济等特点。它不需要专业技能和昂贵复杂的仪器设备即可实现对抗原、半抗原、抗体等各种分析物的定性和半定量检测。它广泛应用于激素、肿瘤标记物、药物、细菌、病毒等物质的检测。而抗原抗体作为该技术必不可少的原料，因此有必要提供一种有效的苯海索抗原抗体的制备方法，可用于对苯海索的免疫分析。
6、由于包括苯海索在内的大多数小分子化合物(分子量小于1000)，不具有免疫原性，即缺乏t细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，故小分子物质被称为半抗原。通过适当的化学修饰，在半抗原分子结构的某个位置上带上端部为活性基团的连接臂，再与大分子载体结合，生成半抗原-载体偶联物(即人工抗原)，人工抗原可以借助t细胞表位来间接诱导b细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体，从而制备出抗苯海索抗体。
7、现有技术中还未有苯海索人工半抗原、人工抗原的相关报道。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的不足之处，本专利技术提供一种苯海索人工半抗原、人工抗原及其制备方法，并将苯海索人工抗原应用于检测灵敏度高、特异性强的抗苯海索抗体的制备中。
2、为实现上述专利技术目的，本专利技术通过以下技术方案实现：
3、一种苯海索人工半抗原，其分子结构式如式(ⅰ)所示：
4、
5、本专利技术提供的苯海索人工半抗原最大程度地保留了苯海索的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇。
6、如上所述的一种苯海索人工半抗原的制备方法，包括以下步骤：
7、(s.1)将浓氨水用去离子水稀释，然后加入苯海索盐酸盐，得到游离态的苯海索，将游离态的苯海索与溴乙酸乙酯混合于n,n-二甲基甲酰胺中，加入氢化钠，加热并搅拌回流至反应结束，转干，加入去离子水，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并干燥、过滤、转干、分离提纯，得到白色固体a；
8、(s.2)将步骤(s.1)中得到的白色固体a溶解于甲醇和四氢呋喃中，加入氢氧化钠溶液，加热搅拌至反应完全，用盐酸调ph并用乙酸乙酯萃取，转干、分离提纯，得到苯海索人工半抗原ⅰ。
9、本专利技术采用n,n-二甲基甲酰胺-氢化钠体系并以氢化钠为催化剂，有助于更好地将连接臂与游离态苯海索相结合，从而有效减少副产物生成，进一步提高产率，节约成本。此外，本专利技术在苯海索的羟基上引入连接臂，通过在该修饰位点上引入连接臂能最大程度地保留苯海索的特征结构。与采用一般的环状结构作为连接臂相比，本专利技术所采用的连接臂为直链结构，有助于减少免疫分析时产生的非特异性结合，还可有效减少免疫时产生的针对连接臂的免疫反应，使人工半抗原的特异性增强，在溶液中保持构象稳定，提高苯海索人工抗原ii的免疫特性。
10、作为优选，步骤(s.1)中游离态的苯海索与溴乙酸乙酯的摩尔比为1:2～10。
11、作为优选，步骤(s.1)中加热并搅拌回流过程的反应温度为60～70℃，反应时间为12～20h；
12、步骤(s.2)中加热搅拌过程的反应温度为0～40℃，反应时间为10～20h。
13、通过控制上述反应温度和反应时间，有助于降低副产物至最少，进而提高产率，降低成本。
14、作为优选，步骤(s.1)中分离提纯过程采用tlc分离提纯方法，使用的展开剂为乙酸乙酯，使用的溶剂和洗脱剂为乙醇。
15、采用乙酸乙酯作为展开剂，有助于将产物分离出来，便于后续操作，节约成本。
16、一种苯海索人工抗原，其分子结构式如式(ⅱ)所示：
17、
18、其中，bgg为牛丙种球蛋白。
19、如上所述的一种苯海索人工抗原的制备方法，包括以下步骤：
20、利用n-羟基琥珀酰亚胺活性酯法将如权利要求1所述的苯海索人工半抗原ⅰ与牛丙种球蛋白结合，得到苯海索人工抗原ⅱ。
21、作为优选，如上所述的一种苯海索人工抗原的制备方法，包括以下步骤：
22、(a)将如权利要求1所述的苯海索人工半抗原ⅰ与环己基碳酰二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺混合于n,n-二甲基甲酰胺中，加热搅拌反应，待反应结束后进行离心，取上清液；
23、(b)将步骤(a)中得到的上清液滴加到牛丙种球蛋白溶液中混合均匀，得到混合液并静置，待反应完全后进行透析、离心，取上清液，得到苯海索人工抗原ⅱ。
24、作为优选，步骤(a)中加入的苯海索人工半抗原ⅰ与环己基碳酰二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1.1～1.5):(1.1～1.5)；
25、步骤(b)中的牛丙种球蛋白溶液的浓度为4～6mg/ml；混合过程加入的步骤(a)中得到的上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1:8～12。
26、作为进一步优选，所述牛丙种球蛋白溶液的制备方法包括以下步骤：
27、将牛丙种球蛋白溶于0.01m的pbs缓冲液中，所述pbs缓冲液的ph为7.2～7.4。
28、本专利技术选用牛丙种球蛋白作为大分子载体，与传统的牛血清蛋白相比，具有以下优点：(1)本专利技术的牛丙种球蛋白具有较强的免疫原性，免疫新西兰白兔，能够更容易得到较高效价的血清；
29、(2)从抗原抗体结合测试来看，用牛丙种球蛋白作为载体得到的人工抗原与苯海索抗体结合具有本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种苯海索人工半抗原，其特征在于，其分子结构式如式(Ⅰ)所示：
2.如权利要求1所述的一种苯海索人工半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(S.1)将浓氨水用去离子水稀释，然后加入苯海索盐酸盐，得到游离态的苯海索，将游离态的苯海索与溴乙酸乙酯混合于N,N-二甲基甲酰胺中，加入氢化钠，加热并搅拌回流至反应结束，转干，加入去离子水，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并干燥、过滤、转干、分离提纯，得到白色固体A；
3.根据权利要求2所述的一种苯海索人工半抗原的制备方法，其特征在于，步骤(S.1)中游离态的苯海索与溴乙酸乙酯的摩尔比为1:2～10。
4.根据权利要求2所述的一种苯海索人工半抗原的制备方法，其特征在于，
5.一种苯海索人工抗原，其特征在于，其分子结构式如式(Ⅱ)所示：
6.如权利要求5所述的一种苯海索人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的一种苯海索人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的一种苯海索人工抗原的制备方法，其特征在于，
9.如权利要求5所述的苯海索人工抗原在制备抗苯海索抗体中的应用。
10.一种抗苯海索抗体，其特征在于，是由如权利要求5所述的苯海索人工抗原经动物免疫得到且可与苯海索及其类似物发生特异性免疫反应的球蛋白。
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【技术特征摘要】
1.一种苯海索人工半抗原，其特征在于，其分子结构式如式(ⅰ)所示：
2.如权利要求1所述的一种苯海索人工半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(s.1)将浓氨水用去离子水稀释，然后加入苯海索盐酸盐，得到游离态的苯海索，将游离态的苯海索与溴乙酸乙酯混合于n,n-二甲基甲酰胺中，加入氢化钠，加热并搅拌回流至反应结束，转干，加入去离子水，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并干燥、过滤、转干、分离提纯，得到白色固体a；
3.根据权利要求2所述的一种苯海索人工半抗原的制备方法，其特征在于，步骤(s.1)中游离态的苯海索与溴乙酸乙酯的摩尔比为1:2～10。
4.根据权利要求2所述的一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢瑾，吴银飞，邵越水，王镇，徐建，
申请(专利权)人：杭州同舟生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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