【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及耗竭探针。
技术介绍
1、转录组是指细胞或生物体在给定时间的rna转录物。转录组的知识揭示了活跃的细胞过程，并且可以提供关于细胞调节、生长和功能障碍的信息。
2、转录组分析通常涉及微阵列技术，并且更常见地涉及下一代测序技术(例如，rna-seq)。rna-seq的常见目标是检测存在的不同转录物中的所有转录物(包括mrna和非编码rna)，以及检测剪接变体、突变、移动遗传元件和在各种发育阶段或在各种条件下的表达水平。转录组学和rna-seq应用于诊断学、疾病分析、病原体检测、进化生物学和其它研究领域。例如，rna-seq可以潜在地识别与对环境压力的抗性(如作物的抗旱性)相关的基因。在另一个实例中，转录组分析可以提供关于药物抗性的机制的信息，从而潜在地揭示用于对抗医院获得性抗生素抗性感染的策略。
技术实现思路
1、本专利技术提供了rna耗竭探针、即短dna寡核苷酸的组，所述短dna寡核苷酸沿着来自样品中的将被耗竭的rna的长度杂交。dna寡核苷酸介导rnase h对靶rna的消化。本专利技术可用于从样品中去除非靶rna，以便促进低丰度rna的捕获或简单地实现靶rna的更高产率。根据本专利技术的耗竭探针基于探针/靶标相互作用的生物化学和生物物理特性进行设计，以使得一组耗竭探针中的所有耗竭探针表现出均匀、一致的行为。例如，耗竭探针可以被设计成具有在窄的、预定义的范围内的熔解(melting temperature)温度(tm)。本专利技术的探针被设计成实现改善的性能，
2、不受不规则间距的影响，由于合理的基于生物学的设计(所述设计对tm进行建模并且筛选参考rna序列数据以省略具有脱靶匹配的候选探针序列)，本专利技术的探针组优于现有技术的探针组。现有技术的探针组牺牲了完全缺失，以便实现沿着要去除的rna的均匀探针结合。由于探针组必须以均匀间距和熔解温度沿着rna的长度平铺的限制性假设，许多探针由于如gc含量、二级结构或长度等因素而结合不良。本专利技术通过使用在选择的熔解温度窗口内工作并减少脱靶结合的设计方法来解决这些问题。
3、本专利技术的探针沿着一个或多个rna分子以不可预测的、明显随机的间距形成异源双链体(heteroduplex)。事实上，本专利技术的探针组可能留下长的rna间隙——在一些情况下，间隙高达超过约100个碱基——但仍优于现有技术的探针组，所述现有技术的探针组被设计成沿着靶rna遵循一些简单的短、规则的间隙模式。另外，即使在高度分解的样品中，本专利技术的探针也显示出了改善的耗竭。根据本专利技术的探针设计的另一个优点在于，其允许探针杂交和rna消化在单个、快速步骤中发生，而不是使用加热/冷却循环，然后是漫长且次优的消化温度。因为本专利技术的探针组使用被设计成利用异源双链体形成的实际序列内容和生物物理特性的探针，因此使用本专利技术的探针组的rna耗竭可靠地从样品中去除了过量的rna。因为此类工具可以用于可靠地去除rna，如核糖体rna和/或珠蛋白转录物，因此使用本专利技术的探针组的rna-seq测定更好地检测剩余且有时罕见的mrna转录物。因为罕见的遗传事件是如癌症或病原性感染等关键条件的标志物，因此本专利技术的探针组可用于早期且准确地检测关键生物信息。
4、在某些方面，本专利技术提供了用于耗竭rna的方法。优选的方法包括将多个dna寡核苷酸与样品中的靶rna分子杂交以形成异源双链体，其中所述dna寡核苷酸具有被选择以实现以下的序列：(i)使所述异源双链体的熔解温度在预定范围内，以及(ii)使与参考脱靶rna的匹配最小化。本专利技术的方法进一步包括消化所述异源双链体中的rna。所述异源双链体可以沿着所述rna分子以非均匀分布形成。所述dna寡核苷酸可以包括低gc寡核苷酸和熔解温度高于所述低gc寡核苷酸的高gc寡核苷酸。所述dna寡核苷酸可以包括低gc寡核苷酸和比所述低gc寡核苷酸更短的高gc寡核苷酸。所述dna寡核苷酸可以被选择以使相邻异源双链体之间的间距最小化，并且可以以非均匀的浓度存在。
5、在一些实施例中，dna寡核苷酸通过以下方式进行选择：生成一组与靶rna(在此情况下，是要去除的rna)互补的候选序列，其中预测的熔解温度在预定范围内；至少部分地基于与所述参考脱靶rna的匹配评分来为所述候选序列中的每个候选序列分配成本函数(cost function)；以及选择一组映射到沿着rna分子的位置的候选序列，其中所述组是通过使累积成本函数、位置间间隙和/或重叠最小化的算法进行选择的。所述dna序列可以由计算机系统选择以提供dna寡核苷酸，所述dna寡核苷酸各自以类似的退火温度、以最小或没有重叠并且以最小或没有退火脱靶rna来唯一地退火rna分子。任选地，计算机系统进一步选择序列，以提供具有最小长度的dna寡核苷酸和/或使异源双链体之间的间隙最小化。
6、在一些实施例中，dna寡核苷酸被测试并且显示出不与标准化人参考rna提取物中的蛋白质编码转录物稳定杂交。靶rna分子可以包括核糖体rna、珠蛋白转录物或线粒体rna中的任何一种。优选的方法包括进行所述步骤以消化样品中的核糖体rna和珠蛋白转录物。消化步骤可以包括用rnaseh处理所述样品。另外，优选的方法可以包括在消化步骤之后逆转录样品中的非靶rna分子。在优选的实施例中，异源双链体在沿着rna分子的位置处形成，所述位置不形成任何规则、重复或均匀的模式或间距。例如，异源双链体之间的间距可以是高度可变的和/数学上随机的。异源双链体的定位可以留下具有至少约10个至约100个碱基的rna分子的一个或多个未覆盖区。此外，覆盖不需要是端到端的，这意指5'和3'端序列可以是未覆盖的。
7、本专利技术的方法可以增加样品中poly-a尾rna(poly-a tailed rna)与非编码rna的比率。dna寡核苷酸中的至少两个dna寡核苷酸的序列被选择以在彼此重叠或邻接的位置处与要耗竭的rna杂交。本专利技术中使用的dna寡核苷酸的长度可以是约20个碱基至约40个碱基(例如，在介于18个与44个之间变化，包含端值)。所述dna寡核苷酸可以以非等摩尔浓度存在于混合物中。例如，基于经验性观察结果，探针中的一些探针的浓度可能得到增强，例如翻倍。
8、本专利技术的方面提供了一组rna耗竭探针。示例性组包括与要耗竭的rna杂交以形成异源双链体的多个dna寡核苷酸，其中所述dna寡核苷酸具有被选择以实现以下的序列：(i)使所述异源双链体的熔解温度在预定范围内，以及(ii)使与脱靶rna的匹配最小化。优选地，所述异源双链体沿着rna分子以非均匀分布形成。所述组中的异源双链体之间的间距可以是高度可变的和/或数学上随机的。所述dna寡核苷酸可以被选择以使相邻异源双链体之间的间距最小化。所述dna寡核苷酸可以包括低gc寡核苷酸和高gc寡核苷酸两者(所述高gc寡核苷酸的熔解温度高于所述低gc寡核苷酸和/或比所述低gc寡核苷酸更短)。所述探针组可以通过以下方式进行设计：生成一组与本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于耗竭RNA的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中多个所述DNA寡核苷酸沿着所述子集中的RNA分子的长度形成异源双链体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸沿着所述子集中的RNA分子以非均匀分布形成异源双链体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸形成沿着所述RNA子集的成员的长度平铺的异源双链体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述寡核苷酸的设计旨在使相邻异源双链体之间的间距最小化。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述预定的熔解温度范围针对所述DNA寡核苷酸的特定序列进行了优化，以使与所述子集中的RNA的结合最大化。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸的序列通过以下方式选择：
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNA子集选自由核糖体RNA、珠蛋白转录物和线粒体RNA组成的组。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述消化步骤包括用RNAseH处理所述样品。
10.根据权利要求1所述
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述异源双链体之间的间距在数学上是随机的。
12.根据权利要求1所述的方法，其中选择所述DNA寡核苷酸中的至少两个DNA寡核苷酸的序列，以在重叠或邻接的位置处与所述RNA子集杂交。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸具有从约18个碱基至约44个碱基不等的长度。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸以非等摩尔浓度存在于所述混合物中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中在进行所述杂交和消化之前，将所述RNA、所述DNA寡核苷酸和所述RnaseH一起添加到单管中。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于耗竭rna的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中多个所述dna寡核苷酸沿着所述子集中的rna分子的长度形成异源双链体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述dna寡核苷酸沿着所述子集中的rna分子以非均匀分布形成异源双链体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述dna寡核苷酸形成沿着所述rna子集的成员的长度平铺的异源双链体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述寡核苷酸的设计旨在使相邻异源双链体之间的间距最小化。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述预定的熔解温度范围针对所述dna寡核苷酸的特定序列进行了优化，以使与所述子集中的rna的结合最大化。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述dna寡核苷酸的序列通过以下方式选择：
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述rna子集选自由核糖体rna、珠蛋白转录...
【专利技术属性】
技术研发人员：T·J·桑德斯，M·拉尼克，B·A·库德洛，
申请(专利权)人：沃奇酶科基因组学公司，
类型：发明
国别省市：
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