【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种完整腺病毒颗粒的检测方法。
技术介绍
1、腺病毒发现60余年来，腺病毒感染全球普遍存在，时有局部暴发流行。腺病毒感染严重危害人类健康，快速准确的从临床样本和环境中检测完整腺病毒颗粒对评价感染风险和遏制腺病毒感染至关重要。
2、腺病毒(adenovirus，ad)是一种球形、无包膜的二十面体立体对称结构的病毒，直径大约70-90nm，其基因组为线性、非分段的双链dna，长度约25-45kb，可编码多个蛋白质。每个基因组两端都有倒置末端重复序列(invertedterminalre-peat，itr)。腺病毒衣壳由252个壳粒组成，其中240个为六邻体(hexon)，12个为五邻体(penton)。每个六邻体是六邻体蛋白的同源三聚体，三聚体的六邻体分子有一个三角形的塔尖和五面体的基底。以五邻体蛋白为基底可延伸出一纤毛(fiber)，纤毛顶端有一个膨隆为头节区(knob)，可与细胞表面受体相结合，可在病毒感染过程中发挥重要的作用。腺病毒感染宿主细胞后，其基因组进入细胞核，进行转录和复制。腺病毒的生命周期分为早期和晚期两个阶段，早期基因主要涉及调控宿主细胞环境以利于病毒复制，而晚期基因则主要编码病毒的结构蛋白。完成复制后，新合成的病毒粒子在细胞裂解或出泡方式下释放，进而感染其他细胞。腺病毒以多种形式分泌，只含有病毒衣壳蛋白而不含核酸，或仅含有病毒dna片段，这些并不具有病毒感染活性，其中完整腺病毒颗粒是唯一具有感染性的病毒颗粒。
3、截至目前，各个领域针对腺病毒检测方法有很多，通过
4、为此，本专利技术利用高特异性和亲和性的蛋白抗体和实时定量pcr开发了一种新的免疫分子法，利用偶联了抗体的磁珠对不同的病毒颗粒进行捕获，然后进行dna水平的测定，来准确、快速地检测完整腺病毒颗粒的含量，从而有利于腺病毒在肿瘤、基因治疗、疫苗载体领域发挥极大的作用，为人类战胜病魔提供了新的解决思路。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种能够利用高特异性和高亲和性的蛋白抗体与实时定量pcr，通过偶联了抗体的磁珠对不同的病毒颗粒进行捕获，进行dna水平的测定，来准确、快速地检测完整腺病毒颗粒的含量的一种新的免疫分子法，已解决现有技术中检测方法不能完整腺病毒颗粒的技术问题。
2、为了达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术提供了一种完整腺病毒颗粒的检测方法，包括如下步骤：
4、s1、进行羧基磁珠和腺病毒抗体的偶联，获得羧基磁珠-抗体复合物；
5、s2、采用步骤s1获得的羧基磁珠-抗体复合物对完整腺病毒颗粒进行腺病毒捕获；
6、s3、分离病毒上清和磁珠；
7、s4、提取腺病毒核酸；
8、s5、利用qpcr进行腺病毒核酸检测。
9、优选的，在步骤s1中，所述活化磁珠的制备方法为：将羧基磁珠用0.015m ph5.5的mes缓冲液震荡洗涤后，再加入edc/nhs偶联剂溶液涡混匀，10-30℃反应。
10、优选的，所述edc/nhs偶联剂与羧基磁珠的质量比为20ug/mg。
11、优选的，所述偶联的具体操作为：活化磁珠用0.015m ph5.5mes缓冲液洗涤后，加入用0.015m ph5.5mes缓冲液稀释后的pix抗体，10-30℃旋转孵育4h以上；分离弃上清液，加入200μl磁珠封闭液10-30℃旋转孵育1h后，分离弃上清液，保存液(pbst缓冲液)洗涤磁珠，，重悬至10g/l，得到羧基磁珠-抗体复合物，4℃保存备用；所述腺病毒抗体与羧基磁珠的质量比不少于75ug/mg。
12、优选的，在步骤s2中，所述完整腺病毒为tgf-tgfβ1或fgf2腺病毒颗粒。
13、优选的，在步骤s2中，所述所述腺病毒捕获的方法如下：取一定量步骤s1制备的s1获得的羧基磁珠-抗体复合物于ep管，加入5μl完整腺病毒颗粒，再加入400μlpbs缓冲液，在一定温度下旋转孵育。
14、优选的，所述羧基磁珠-抗体复合物的用量为10-40ul。
15、优选的，所述孵育的时间为15-60min。
16、优选的，所述孵育的温度为4℃-25℃。
17、优选的，完整腺病毒颗粒为完整的tgf-tgfβ1和fgf2腺病毒颗粒。
18、优选的，在步骤s5中，用于检测tgf-tgfβ1腺病毒核酸的引物对序列如下：
19、tgf-tgfβ1f：tcaggctgctgagactcaaa；
20、tgf-tgfβ1r：ctcacaacaccggtcacatc。
21、本专利技术解决技术问题的难度及意义在于：
22、现有技术针对腺病毒检测方法虽然有很多，如免疫学方法进行病毒抗原和抗体检测，利用定量聚合酶链式反应(qpcr)、环介导等温扩增法(lamp)检测病毒核酸等等，但是上述方法并不能真正反应病毒感染和复制能力，也就是无法检测完成的腺病毒颗粒。因此，围绕上述技术问题，基于腺病毒和特异性抗体反应的特点，本专利技术计了一个免疫分子平台用于检测完整腺病毒颗粒，该平台的设计原理是利用抗体的氨基和羧基磁珠的羧基共价结合形成肽键从而将腺病毒蛋白抗体(pix抗体)与羧基磁珠相偶联，偶联成功的羧基磁珠-抗体复合物(mb-pix)与tgf-tgfβ1完整腺病毒(tgf-tgfβ1腺病毒)在室温下孵育60min后，可特异性捕获带有pix蛋白的腺病毒颗粒，接着利用磁力架分离磁珠和上清，可以去除游离的核酸和缺乏衣壳蛋白的非完整病毒颗粒，随后收集的腺病毒颗粒可通过实时荧光定量pcr来进行核酸检测，排除了空病毒粒子的影响，确保本专利技术的检测只针对完整腺病毒颗粒。
23、综上所述，与现有技术相比，本专利技术方案具备以下有益效果：
24、对于完整病毒颗粒的检测，传统方法例如particle gel assay，需要的样品量大，步骤繁琐，处理时间长，而本专利技术方法可以快速准确的检测完整病毒颗粒；且本专利技术可以基于抗原抗体特异性结合将不同病毒颗粒分开，进而准确检测完整病毒颗粒，将有助于了解腺病毒的感染状态、评价抗病毒疗效，为临床合理用药提供指导。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种完整腺病毒颗粒的检测方法，其特征是：包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的一种完整腺病毒颗粒的检测方法，其特征是：在步骤S1中，所述活化磁珠的制备方法为：将羧基磁珠用0.015MpH5.5的MES缓冲液震荡洗涤后，再加入EDC/NHS偶联剂溶液涡混匀，10-30℃反应。
3.如权利要求2所述的一种完整腺病毒颗粒的检测方法，其特征是：所述EDC/NHS偶联剂与羧基磁珠的质量比为20ug/mg。
4.如权利要求3所述的一种完整腺病毒颗粒的检测方法，其特征是：所述偶联的具体操作为：活化磁珠用0.015M pH5.5MES缓冲液洗涤后，加入用0.015M pH5.5MES缓冲液稀释后的PIX抗体，10-30℃旋转孵育4h以上；分离弃上清液，加入200μL磁珠封闭液10-30℃旋转孵育1h后，分离弃上清液，保存液洗涤磁珠，重悬至10g/L，4℃保存备用，得到羧基磁珠-抗体复合物；所述腺病毒抗体与羧基磁珠的质量比不少于75ug/mg。
5.如权利要求2所述的一种完整腺病毒颗粒的检测方法，其特征是：在步骤S2中，所述完整腺病毒为TGF-T
6.如权利要求1所述的一种完整腺病毒颗粒的检测方法，其特征是：在步骤S2中，所述腺病毒捕获的方法如下：取一定量步骤S1制备的S1获得的羧基磁珠-抗体复合物于EP管，加入5μL完整腺病毒颗粒，再加入400μL PBS缓冲液，在一定温度下旋转孵育。
7.如权利要求4所述的一种完整腺病毒颗粒的检测方法，其特征是：所述羧基磁珠-抗体复合物的用量为10-40ul。
8.如权利要求4所述的一种完整腺病毒颗粒的检测方法，其特征是：所述孵育的时间为15-60min。
9.如权利要求4所述的一种完整腺病毒颗粒的检测方法，其特征是：所述孵育的温度为4℃-25℃。
10.如权利要求4所述的一种完整腺病毒颗粒的检测方法，其特征是：在步骤S5中，用于检测TGF-TGFβ1腺病毒核酸的引物对序列如下：
...【技术特征摘要】
1.一种完整腺病毒颗粒的检测方法，其特征是：包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的一种完整腺病毒颗粒的检测方法，其特征是：在步骤s1中，所述活化磁珠的制备方法为：将羧基磁珠用0.015mph5.5的mes缓冲液震荡洗涤后，再加入edc/nhs偶联剂溶液涡混匀，10-30℃反应。
3.如权利要求2所述的一种完整腺病毒颗粒的检测方法，其特征是：所述edc/nhs偶联剂与羧基磁珠的质量比为20ug/mg。
4.如权利要求3所述的一种完整腺病毒颗粒的检测方法，其特征是：所述偶联的具体操作为：活化磁珠用0.015m ph5.5mes缓冲液洗涤后，加入用0.015m ph5.5mes缓冲液稀释后的pix抗体，10-30℃旋转孵育4h以上；分离弃上清液，加入200μl磁珠封闭液10-30℃旋转孵育1h后，分离弃上清液，保存液洗涤磁珠，重悬至10g/l，4℃保存备用，得到羧基磁珠-抗体复合物；所述腺病毒抗体与羧基磁珠的质量比不少于75ug/mg。
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。