【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒医药，特别是一种内含基因组ⅰ/基因组ⅱ（gⅰ/gⅱ）型诺如病毒核酸片段的假病毒颗粒制备方法及其应用。
技术介绍
1、诺如病毒（norovirus, nov）隶属杯状病毒科，是一种无包膜单股正链rna病毒，基因组长度约为7.5kb，球形，呈二十面体对称，直径约为38nm。nov现已是引起人非细菌性急性胃肠炎/腹泻相关的主要病原体，据世界卫生组织（world health organization, who）统计，全球每年约有20万低龄幼儿因感染诺如病毒致死。目前，nov在世界各地持续流行，已成为全球共同面临的公共卫生健康问题。在nov的各种基因型中，基因组ⅰ和基因组ⅱ的流行最易感染人类，分别约占10%和90%。由于难以实现诺如病毒体外分离培养，无法进行血清型鉴定，很难进行方法间的试验比较，因此加强nov快速检测，对于保障食品安全和民众健康具有重要意义。
2、nov感染是季节流行性的，多发在冬季，尤其在高纬度地区国家，所以被称为“胃肠道流感”或“冬季呕吐病”。nov是一种肠道病毒，人感染发病后主要表现症状为腹痛、腹泻、呕吐，并且通常持续时间相对较短，在我国属于法定的丙类传染病。nov通过粪口途径或气溶胶呕吐物直接在人与人之间传播，也可以通过受污染的食物、水或环境表面间接传播。但更值得注意的是，nov存在严重的二次传播危险，同时，该病毒还可能会发生物种间的传播。
3、根据基因结构特征，nov分为10个基因群（gi-gx），不同基因群进一步被分为48个基因型，同一基因型又可细分为不同的变异株，其
4、（1）酶标抗体（elisa）试剂盒检测，nov有几种基于elisa的商用检测试剂盒，如英国oxoid ltd公司开发的ideiatm诺如病毒试剂盒、德国r-biopham公司开发的ridascreen®诺如病毒试剂盒，但这些试剂盒灵敏度和特异性差异较大，一方面是因为nov的抗原表位在不同类型上有一定的差异，另一方面随着nov的不断变异，会发生一定的抗原漂移，会导致漏检；
5、（2）分子生物学检测（rt-pcr），在前检测病毒中应用最广泛，主要包括常规荧光定量pcr（real-time pcr, rt-pcr）、巢式pcr、多重rt-pcr、rt-qpcr以及新兴数字pcr等。由于rt-pcr、巢式pcr等存在一些缺陷，逐渐被其他方法所替代，目前，rt-qpcr被认为是novs检测的“金标准”。但由于病毒的变异和重组，针对特定毒株的引物和探针不能检测所有的毒株，常常导致漏检，所以能够检测所有毒株的引物和探针的设计就显得非常关键。由于诺如病毒潜在的传染性及其rna的不稳定性，因此，如何研制耐受rnase攻击、安全无污染阳性质控品，对于诺如病毒rt-pcr试剂盒的研发具有重要意义。
6、ms2噬菌体为正义单链rna噬菌体，基因组全长3659bp，编码4种蛋白：主要外壳蛋白（cp）、成熟蛋白（a蛋白）、复制酶蛋白（基因组增殖所需的rna聚合酶）和裂解蛋白。它由180个14kda衣壳蛋白分子拷贝和1分子成熟酶蛋白拷贝组成，成熟酶不仅可以保护rna基因组免受核酸酶的降解，而且还是噬菌体侵染大肠杆菌的受体结合蛋白。ms2噬菌体样颗粒作为一种非病毒载体递送系统，可以通过与适配体或共价结合靶向特定细胞，已被证明具有作为递送平台的许多特征。一方面，这些颗粒可以通过重组蛋白技术很容易地制备；另一方面，ms2衣壳蛋白与rna或dna的pac位点相互作用，可以包装位于pac位点5′末端的靶rna或dna，从而保护靶rna或脱氧核糖核酸不被核酸酶降解。ms2 vlp能够提供有效、方便的包装各种试剂的方式和向靶细胞递送的方式，已经在诊断试剂外标品方面得到广泛应用。但如何制备内含gⅰ/gⅱ型诺如病毒核酸片段的假病毒颗粒，并实现在制备抑制诺如病毒药物中的应用及在制备检测诺如病毒试剂盒中的应用，至今未见有公开报导。
技术实现思路
1、针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种内含gⅰ/gⅱ型诺如病毒核酸片段的假病毒颗粒制备方法及其应用，可有效解决在制备抑制诺如病毒药物中的应用及在制备检测诺如病毒试剂盒中的应用问题。
2、本专利技术解决的技术方案是，一种内含gⅰ/gⅱ型诺如病毒核酸片段的假病毒颗粒制备方法，包括以下步骤：
3、（1）构建pet28a/cp重组质粒：
4、由携带有ms2噬菌体外壳蛋白cp基因和pac位点基因重组构成（公知产品，如云舟生物科技（广州）股份公司的产品）；
5、（2）构建pet28a/cp-ngi/ngii重组质粒：
6、以puc57为模板，ngi-f和ngii-r为引物，扩增ngi/ngii特异性保守序列，用 bamh ⅰ和 hind ⅲ分别双酶切质粒pet28a(+)/cp和pcr扩增的目的基因靶序列，回收、连接，转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中；提取质粒，通过pcr和测序进行鉴定，得pet28a(+)/cp-ngi/ngii；
7、ngi-f基因序列（seq id no.1）: cgggatcccgctggatgcgnttccat
8、ngii-r基因序列（seq id no.4）: cccaagctttcgacgccatcttcattcaca
9、其中上述ngi-f引物ggatcc为 bam h ⅰ酶切位点，ngii-r引物aagctt为 hind ⅲ酶切位点；
10、ngi/ngii基因序列（seq id no.5）：
11、cgctggatgcgcttccatgacctcggattgtggacaggagatcgcgatcttctgcccgaattcgtaaatgatgatggcgtctaaggaagctcatgttcagatggatgagattctcagatctgagcacgtgggagggcgatcgcaatctggctcccagctttgtgaatgaagatggcgtcga
12、（3）诱导表达
13、将重组质粒表达载体转化大肠杆菌bl21(de3)，得到重组菌体，诱导重组菌体，使其表达所述病毒样颗粒；收集菌体，并加入ph7-9的pbs缓冲液（裂解液），超声、破碎菌体以获取所述病毒样颗粒；
14、（4）纯化
15、向重组菌体中加入硫酸铵对所述病毒样颗粒进行粗沉，使硫酸铵的质量浓度为10-50%；再采用凝胶过滤层析sephacryl-1000对粗沉得到的含有病毒样颗粒的样品进行精纯，先用5倍本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种内含GⅠ/GⅡ型诺如病毒核酸片段的假病毒颗粒制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的内含GⅠ/GⅡ型诺如病毒核酸片段的假病毒颗粒制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.权利要求1或2所述方法制备的内含GⅠ/GⅡ型诺如病毒核酸片段的假病毒颗粒在制备抑制诺如病毒药物中的应用。
4.权利要求1或2所述方法制备的内含GⅠ/GⅡ型诺如病毒核酸片段的假病毒颗粒在制备检测诺如病毒试剂盒中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种内含gⅰ/gⅱ型诺如病毒核酸片段的假病毒颗粒制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的内含gⅰ/gⅱ型诺如病毒核酸片段的假病毒颗粒制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.权...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙新城，王国强，周军，李爽，李玉林，张靖楠，张思威，王宏伟，张华，
申请(专利权)人：郑州轻工业大学，
类型：发明
国别省市：
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