【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于白蚁鸡枞菌种植领域，具体是一种可规模化接种生产高活力白蚁鸡枞菌共生巢的方法。
技术介绍
1、白蚁属于蜚蠊目等翅亚目昆虫，与蟑螂是近亲。培菌白蚁是重要的土壤改善昆虫，对区域内生态系统的稳定起到关键作用。白蚁成虫主要以枯死的动植物为食，在为环境提供丰富的氮素营养的同时，也为其他食蚁动物(如鸟类、捕食蚂蚁、蝙蝠等)提供了丰富的食物；死亡的白蚁成虫分解后产生的氮素营养又为一些浅根系植物和幼苗提供肥料。但是随着环境的改变和农药的过度使用，培菌白蚁蚁巢的数量逐年快速减少，影响生态系统的稳定。
2、在长期的进化过程中，白蚁和鸡枞菌逐渐进化为共生生态系统，白蚁传播鸡枞菌的孢子和菌丝体，培养菌丝体，也取食培养出来的鸡枞菌菌丝体作为食物，因此，为了保护和开发培菌白蚁的生态服务功能，可以利用鸡枞菌菌种对培菌白蚁进行培育，其中蚁苗的接种是实现高效培育的关键环节，培菌白蚁建巢成功的关键是刚产生初代工蚁的新生巢群，能够获得鸡枞菌的菌种，并产生菌圃。
3、现有的培养白蚁鸡枞菌方法中，均没有在新生蚁巢引入稳定的协同微生物群落，同样在没有控制培养条件下，导致蚁巢内微生物群落紊乱这就使即使蚁巢能够接种成功并产生小菌圃，在后期或者放养后仍然会遭受拮抗菌的入侵，并最终导致菌圃萎缩，建巢失败。特别是土白蚁属白蚁作为的主要鸡枞菌共生蚁种，蚁巢成活率较低，导致菌圃自然建立的成功率也较低，限制了白蚁鸡枞菌产业的规模发展。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种可规模化接种生产高活力白蚁鸡枞菌共生巢的方法，包括以下步骤：
3、(1)肠道微生物菌群培养：将培菌白蚁的肠道微解剖取出肠段，在无菌环境下将肠段内的肠道微生物接种在肠道微生物培养基质中，缓冲调节ph为3.0～7.0，充入0.5～10v％co2/n2的混合气置换保护，5～200rpm搅拌在21～45℃厌氧培养0.5～3天，菌群计数浓度达到105～108个/ml时，4.0～15.0℃低温保存备用，然后再经过多级1:1～1:100间的比例放大培养到0.1～100l，充入0.5～10v％co2/n2的混合气置换成无氧环境，4.0～15.0℃低温保存备用；
4、所述的肠道微生物培养基质的获取方法是：取饲喂洁净草料的新鲜牛胃物或新鲜健康牛粪，经无菌水浸提后留取浸出液，粗滤后再用细菌滤膜过滤，留取滤液，60～90℃，5～20s快速巴氏灭菌。
5、(2)协同微生物菌群培养：将从白蚁-鸡枞菌菌圃中分离的协同好氧细菌菌种接种到添加碳源和氮源的缓冲培养液或专用培养液中，在ph为3.0～7.0、温度为21～45℃，10～20v％o2/n2低氧环境中，培养0.1～3.0d，菌群计数浓度达到105～109个/ml时，8～15℃低温保存备用；
6、所述的协同好氧细菌包括芽孢杆菌属bacillus菌种a 0～100％、b 0～100％、c0～100％、d 0～100％和e 0～100％，梭菌属clostridium菌种f 0.1～5％，放线菌门菌种g0～1.0％。
7、(3)高纯度鸡枞菌液体菌种制备：将新鲜鸡枞菌子实体表面消毒后，解剖并获取内部组织，无菌条件下接种于特制固体培养基上，15～25v％低o2、19～31℃纯化培养3～30d，取每次纯化培养后的鸡枞菌菌种重复操作1～5次去除拮抗菌，获得高纯度鸡枞菌菌种；再将获取的高纯度鸡枞菌菌种在无菌条件下按1:10～1:100的重量比接入到特制液体培养基中，在10～25v％低o2和0.5～10v％高co2气体氛围中，21～35℃，10～120rpm振荡培育3～30d，得到菌丝含量为0.001～0.1g/ml的鸡枞菌液体菌种，通过横向传代方法接种；
8、所述的鸡枞菌为共生蚁菌属termitomyces真菌，包括个体大型假根膨大的球形蚁巢伞t.globulus、粗柄蚁巢伞t.robustus、球根蚁巢伞t.bulborhizus、真根蚁巢伞t.eurrhizus、中型的白柄蚁巢伞t.albiceps、柱状蚁巢伞t.cylindrieus、金黄蚁巢伞t.macrocarpus、条纹蚁巢伞t.striatus、黑盖蚁巢伞t.entolomoides、盾尖蚁巢伞t.clypeatus、间型鸡枞菌t.intermedius、海姆鸡枞菌t.heimi和乳头盖鸡枞菌t.mammiformis等；
9、所述的特制固体培养基包括0.001～1wt％的协同微生物菌群、0.001～0.1wt％的必需增效微量元素成分和余量的ph为3.0～7.0的酸性pda或改良马丁固体培养基；
10、所述的特制液体培养基包括0.001-0.1wt％的必需增效微量元素成分和余量的ph为3.0～7.0的酸性pda或改良马丁固体培养基；
11、所述的必需增效微量元素成分包括0.001～0.1％的fe、mn、mg、zn等元素。
12、(4)制备饲料基质：所述的饲料基质包括成分a和成分b，其中成分a为鸡枞菌高效利用的木质素、半木质素和半纤维素原料，成分b为适合白蚁碳水能量供给的纤维素和半纤维素原料；
13、成分a来源于排出0～3天内、60～90℃、10～40s巴氏灭菌的饲喂洁净草料的新鲜牛粪或100～120℃、1～5h高温高压灭菌处理的褐腐真菌发酵处理的枯死植物材料；
14、成分b来源于100～120℃、1～5h高温高压灭菌处理的饲喂洁净草料的新鲜牛粪或其他真菌发酵处理的枯死植物材料。
15、(5)制备接种饲料；将菌群计数浓度定量的肠道微生物、协同微生物、菌丝含量定量的纯化培养的鸡枞菌液体菌种以及灭菌处理的饲料基质，按特定比例在无菌条件下混合后，制成具有稳定菌种群落的接种饲料，10～20v％o2/n2低氧密封保存。
16、(6)蚁苗接种：选择培菌白蚁初代工蚁活动前1天～活动后15天的蚁苗杯作为待接种蚁巢，无菌条件下，取1～20g接种饲料放置在待接种蚁巢的蚁道上进行蚁苗接种；
17、(7)接种后管理：接种后的蚁巢既要保证白蚁正常呼吸又要防止协同菌消退导致杂菌污染，可以用开有小孔的过氧半透膜封装蚁巢，通过氧半透膜和小孔定量控制含氧量在10～25％；培养温度即要满足微生物的快速生长需要，又要保障白蚁生命安全，选择温度范围为16～32℃；培养基质土绝对含水率维持在8～20％(饱和)，随蚁群活力变化0～60天内逐渐降低，逐步改变微环境让不同生活型微生物随微环境变化而分步定植在种苗内，形成健全的共生微生态本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可规模化接种生产高活力白蚁鸡枞菌共生巢的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的可规模化接种生产高活力白蚁和鸡枞菌共生巢的方法，其特征在于：步骤(1)所述的肠道微生物培养基质的获取方法是：取饲喂洁净草料的新鲜牛胃物或新鲜健康牛粪，经无菌水浸提后留取浸出液，粗滤后再用细菌滤膜过滤，留取滤液，60～90℃，5～20s快速巴氏灭菌。
3.根据权利要求1所述的可规模化接种生产高活力白蚁和鸡枞菌共生巢的方法，其特征在于：步骤(1)所述的肠道微生物菌群还可以从饲喂洁净草料的新鲜牛胃物或新鲜健康牛粪中获取，具体为：取饲喂洁净草料的新鲜牛胃物或新鲜健康牛粪，经无菌水浸提后留取浸出液，粗滤后再用细菌滤膜过滤，留取滤液，加入无菌水调节菌群计数浓度为105～109个/mL，充入O2/CO2/N2的混合气置换成低氧环境，低温保存。
4.根据权利要求1所述的可规模化接种生产高活力白蚁和鸡枞菌共生巢的方法，其特征在于：步骤(3)还可以将新鲜开伞的鸡枞菌子实体表面消毒后，在无菌或者自然环境下，按鸡枞菌鲜重0.001～1wt％的比例添加协同微生物菌群
5.根据权利要求1所述的可规模化接种生产高活力白蚁和鸡枞菌共生巢的方法，其特征在于：步骤(3)所述的特制固体培养基包括0.001～1wt％的协同微生物菌群、0.001～0.1wt％的必需增效微量元素成分和余量的pH为3.0～7.0的酸性PDA或改良马丁固体培养基；
6.根据权利要求1或5所述的可规模化接种生产高活力白蚁和鸡枞菌共生巢的方法，其特征在于：步骤(4)中成分A来源于排出0～3天内、60～90℃、10～40s巴氏灭菌的饲喂洁净草料的新鲜牛粪或100～120℃、1～5h高温高压灭菌处理的褐腐真菌发酵处理的枯死植物材料；
7.根据权利要求1所述的可规模化接种生产高活力白蚁和鸡枞菌共生巢的方法，其特征在于：步骤(5)的接种饲料中也可以不接种鸡枞菌液体菌种，而是在步骤(6)蚁苗接种时将鸡枞菌液体菌种放置在白蚁活动的蚁道上单独接种。
8.根据权利要求1所述的可规模化接种生产高活力白蚁和鸡枞菌共生巢的方法，其特征在于：步骤(5)的接种饲料中也可以不接种鸡枞菌液体菌种，而是利用白蚁成虫自带菌种进行纵向传代接种。
9.根据权利要求1所述的可规模化接种生产高活力白蚁和鸡枞菌共生巢的方法，其特征在于：步骤(6)还可以在无菌车间，用稳定菌群的接种饲料流水线操作往蚁苗杯中定量添加接种饲料和鸡枞菌液体菌种。
10.根据权利要求1所述的可规模化接种生产高活力白蚁和鸡枞菌共生巢的方法，其特征在于：步骤(7)所述的氧半透膜是厚度为2～50μm无毒材质的PE、PVC、PVDC、或PMP膜，小孔直径与蚁巢体积的比例为0.2～1.0mm/50mL。
...【技术特征摘要】
1.一种可规模化接种生产高活力白蚁鸡枞菌共生巢的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的可规模化接种生产高活力白蚁和鸡枞菌共生巢的方法，其特征在于：步骤(1)所述的肠道微生物培养基质的获取方法是：取饲喂洁净草料的新鲜牛胃物或新鲜健康牛粪，经无菌水浸提后留取浸出液，粗滤后再用细菌滤膜过滤，留取滤液，60～90℃，5～20s快速巴氏灭菌。
3.根据权利要求1所述的可规模化接种生产高活力白蚁和鸡枞菌共生巢的方法，其特征在于：步骤(1)所述的肠道微生物菌群还可以从饲喂洁净草料的新鲜牛胃物或新鲜健康牛粪中获取，具体为：取饲喂洁净草料的新鲜牛胃物或新鲜健康牛粪，经无菌水浸提后留取浸出液，粗滤后再用细菌滤膜过滤，留取滤液，加入无菌水调节菌群计数浓度为105～109个/ml，充入o2/co2/n2的混合气置换成低氧环境，低温保存。
4.根据权利要求1所述的可规模化接种生产高活力白蚁和鸡枞菌共生巢的方法，其特征在于：步骤(3)还可以将新鲜开伞的鸡枞菌子实体表面消毒后，在无菌或者自然环境下，按鸡枞菌鲜重0.001～1wt％的比例添加协同微生物菌群的无菌水稀释菌液制成鸡枞菌组织悬浮液，并缓冲调节ph至3.0～7.0，直接用于接种。
5.根据权利要求1所述的可规模化接种生产高活力白蚁和鸡枞菌共生巢的方法，其特征在于：步骤(3)所述的特制固体培养基包括0.001～1wt％的协同微生物菌群...
【专利技术属性】
技术研发人员：文平，黄祥燕，许建初，莫建初，
申请(专利权)人：中国科学院西双版纳热带植物园，
类型：发明
国别省市：
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