【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养，尤其涉及一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法。
技术介绍
1、少突胶质细胞(oligodendrocyte，ol)作为中枢神经系统的重要组成部分，主要负责神经元的髓鞘形成，对神经元信息的快速传导及轴突的功能维持起着至关重要的作用。髓鞘是神经元轴突周围的绝缘层，能够显著提高神经信号的传导速度，是维持神经系统正常功能的关键结构。深入研究少突胶质细胞的生物学特性、功能机制以及其在疾病中的作用，对于理解神经系统的发育、维持与修复具有重要意义。体外培养少突胶质细胞是研究其生物学特性及功能机制的重要手段。
2、然而，少突胶质细胞的体外培养过程复杂且技术难度大，主要原因在于在体外培养过程中易受到多种因素的影响，如培养基成分、生长因子、培养条件等，导致细胞生长缓慢、纯度低、分化难度大等问题；且不同实验室之间的培养条件和方法差异较大，导致实验结果的可重复性和可比性较差，限制了少突胶质细胞研究的深入发展。
3、因此，开发一种简便、高效、稳定的大鼠少突胶质细胞分离培养方法，对于推动少突胶质细胞的深入研究具有重要意义。
技术实现思路
1、针对上述现有技术中存在的不足，本专利技术旨在提供一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，本专利技术综合使用多种培养基从大鼠大脑皮层分离并纯化培养少突胶质细胞前体细胞，通过优化操作步骤、培养基成分以及培养条件等关键参数，摸索出了更加适合大鼠少突胶质细胞前体细胞的培养方法，实现少突胶质细胞的高效分离和纯化，本专利技
2、为了实现上述技术目的，本专利技术的技术方案如下：
3、一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，包括以下步骤：
4、s1：取大鼠大脑皮层制备单细胞悬液；
5、s2：对单细胞悬液进行初步培养，形成混合胶质细胞；
6、s3：从混合胶质细胞中分离少突胶质细胞并纯化；
7、s4：对纯化后的少突胶质细胞进行消化传代培养，得到分化成熟的少突胶质细胞。
8、作为上述技术方案的进一步优选方案：步骤s1中，单细胞悬液的制备过程包括：
9、s11：分离新生的大鼠大脑皮层，置于含消化酶的培养皿中，其中，消化酶为0.05％trypsin-edta；
10、s12：将大鼠大脑皮层剪碎后摇匀，置于37℃培养箱中消化20分钟，每隔5min晃动培养皿，在第10min时取出，每皿加入dna酶，其中，加入的dna酶浓度为10mg/ml，每皿加入的体积为100ul；
11、s13：消化结束后，使用含胎牛血清的完全培养基终止消化，将组织块吹打成单细胞悬液。
12、基于上述技术方案，进一步地，步骤s13中，完全培养基中含有dmem培养基、10％fbs、100u/ml penicillin-streptomycin。
13、作为上述技术方案的进一步优选方案：步骤s2中，形成混合胶质细胞的步骤包括：
14、s21：将单细胞悬液静置后取上清进行离心，吸弃上清后再次重悬细胞，沉淀后离心并吸弃上清，得到细胞a；
15、s22：向细胞a中加入完全培养基，吹打混匀；
16、s23：将步骤s22得到的细胞a接种于浓度为50μg/ml的多聚鸟氨酸包被的t75培养瓶中，培养至第9～10天，星形胶质细胞铺满培养瓶的底部，上层为少突胶质细胞前体细胞，得到混合胶质细胞。
17、作为上述技术方案的进一步优选方案：步骤s3中，从混合胶质细胞中分离少突胶质细胞并纯化的步骤包括：
18、s31：将培养瓶置于恒温摇床振荡，吸弃培养瓶中的培养基；
19、s32：用dmem培养基多次清洗培养瓶后，加入8ml完全培养基，置于培养箱内2～4h；
20、s33：取出培养瓶后密封瓶口，再次振荡，收集振荡后的细胞悬液并过滤；
21、s34：将过滤后的细胞悬液置于未包被的培养皿中静置8～10min，将其中的上清液移入浓度为50μg/ml的多聚鸟氨酸包被的100mm培养皿中，置于培养箱中继续培养；
22、s35：培养2h后吸弃上清，加入增殖培养基培养48h，可见铺满培养皿底的opcs。
23、基于上述方案，进一步地，步骤s31中，恒温摇床以200r/min、37℃振荡2h。
24、基于上述方案，进一步地，步骤s33中，以200r/min、37℃再次振荡18～20h，过滤采用40μm筛网。
25、作为上述技术方案的进一步优选方案：步骤s4中，对纯化后的少突胶质细胞进行消化传代培养的步骤包括：
26、s41：从培养皿中吸弃培养基，用tryple消化细胞；
27、s42：对消化后的细胞计数后接种于6孔板或24孔板，用增殖培养基继续培养48h，换上分化培养基培养3～6天即可分化成熟。
28、基于上述方案，进一步地，步骤s42中，增殖培养基中含有dmem培养基、16μg/mlputrescine、2mm glutamax-i、100u/ml penicillin-streptomycin、1mm sodiumpyruvate、5μg/ml insulin、100μg/ml bsa、100μg/ml transferrin、5μg/ml nac(nac，n-acetyl-l-cysteine)、4.2μg/ml forskolin、60ng/ml progesterone、40ng/ml sodium selenite、10ng/ml d-biotin、2％b27、10ng/ml bfgf、10ng/ml pdgf-aa。
29、基于上述方案，进一步地，步骤s42中，分化培养基中含有dmem/f12培养基、10ng/ml cntf、4mm glutamax、0.1mm sodium pyruvate、0.1％bsa、50μg/ml transferrin、5μg/ml insulin、30nm sodium selenite、10nm d-biotin、15nm3，3'，5-triiodo-l-thyronine(t3)、10nm hydrocortisone。
30、与现有技术相比，本专利技术的技术方案的优点为：
31、1、本专利技术的方法使用多种培养基从新生大鼠大脑皮层分离并纯化培养少突胶质细胞前体细胞，摸索出了适于大鼠少突胶质细胞前体细胞的合理培养方法；该方法操作简单，具有较高的可重复性，不仅能够得到大量纯度为98.2％的少突胶质前体细胞，而且能够最大程度上保持细胞活力和功能，且所得到的少突胶质细胞前体细胞能够冻存，复苏后细胞状态良好。
32、2、本专利技术的方法一次所得的少突胶质细胞前体细胞数量可达2000万个/6瓶t75，并且细胞状态良好，使用dmso本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤S1中，单细胞悬液的制备过程包括：
3.根据权利要求2所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤S13中，完全培养基中含有DMEM培养基、10％FBS、100U/mL Penicillin-Streptomycin。
4.根据权利要求3所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤S2中，形成混合胶质细胞的步骤包括：
5.根据权利要求4所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤S3中，从混合胶质细胞中分离少突胶质细胞并纯化的步骤包括：
6.根据权利要求5所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤S31中，恒温摇床以200r/min、37℃振荡2h。
7.根据权利要求5所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤S33中，以20
8.根据权利要求5所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤S4中，对纯化后的少突胶质细胞进行消化传代培养的步骤包括：
9.根据权利要求8所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，在步骤35与步骤S42中，增殖培养基中含有DMEM培养基、16μg/mL Putrescine、2mMGlutaMAX-I、100U/mL Penicillin-Streptomycin、1mM Sodium pyruvate、5μg/mLInsulin、100μg/mL BSA、100μg/mL Transferrin、5μg/mL NAC、4.2μg/mL Forskolin、60ng/mL Progesterone、40ng/mL Sodium selenite、10ng/mL d-Biotin、2％B27、10ng/mL bFGF、10ng/mL PDGF-aa。
10.根据权利要求8所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤S42中，分化培养基中含有DMEM/F12培养基、10ng/mL CNTF、4mM Glutamax、0.1mMSodiumpyruvate、0.1％BSA、50μg/mL Transferrin、5μg/mL Insulin、30nM Sodiumselenite、10nMd-Biotin、15nM 3，3'，5-Triiodo-L-thyronine、10nM Hydrocortisone。
...【技术特征摘要】
1.一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤s1中，单细胞悬液的制备过程包括：
3.根据权利要求2所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤s13中，完全培养基中含有dmem培养基、10％fbs、100u/ml penicillin-streptomycin。
4.根据权利要求3所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤s2中，形成混合胶质细胞的步骤包括：
5.根据权利要求4所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤s3中，从混合胶质细胞中分离少突胶质细胞并纯化的步骤包括：
6.根据权利要求5所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤s31中，恒温摇床以200r/min、37℃振荡2h。
7.根据权利要求5所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤s33中，以200r/min、37℃再次振荡18～20h，过滤采用40μm筛网。
8.根据权利要求5所述的一种大鼠少突胶质细胞前体细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤s4中，对纯化后的少突胶质细胞进行消化...
【专利技术属性】
技术研发人员：程意琴，张蓬勃，杨柳霏，魏海东，刘慧青，贾鹏宇，陈新林，
申请(专利权)人：西安交通大学医学院第二附属医院，
类型：发明
国别省市：
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