【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物医学技术与医学生物领域，具体涉及一种能够特异性结合tigit的核酸适配体及其筛选与运用。
技术介绍
1、在免疫调节的复杂网络中，t细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域蛋白(t cell immunoglobulin and itim domain，tigit)作为一种新兴的免疫共抑制受体(immune receptor,ir)，其重要性日益凸显。tigit通过与配体(如树突细胞上cd155)结合来调控t细胞和自然杀伤(nk)细胞的功能，传递抑制性信号，降低了这些免疫细胞的活性和增殖能力，进而成为肿瘤细胞逃避免疫系统监视的关键机制之一。多项研究表明，tigit在多种肿瘤中呈现高表达状态，且与不良预后紧密相关，这一发现为肿瘤免疫治疗开辟了新的方向。
2、然而，当前以抗体为基础的免疫疗法在针对tigit的治疗中面临诸多挑战，包括高昂的成本、较低的稳定性以及修饰的复杂性。这些问题限制了抗体疗法在临床上的广泛应用和普及。
3、鉴于上述免疫治疗的缺陷，探索一种新型、高效且经济的替代疗法显得尤为重要。核酸适配体，作为一种通过配体指数富集的系统进化(systematic evolution ofligandsby exponential enrichment，selex)技术筛选获得的单链寡核苷酸，以其独特的优势成为了研究的热点。适配体不仅能够与靶标分子(如tigit)实现高亲和力和强特异性的结合，还具备分子量小、易于大量合成、稳定性高、免疫原性低、易于修饰以及制造成本低等诸多优点。这些特性
4、因此，针对tigit的核酸适配体的开发，旨在克服抗体疗法的局限性，通过特异性结合tigit并调控其在疾病中的作用，为免疫性疾病和肿瘤的治疗提供新的策略和手段。目前，尚未有与tigit具有高亲和力和特异性结合的核酸适配体被报道，因此，筛选和开发此类适配体成为本领域的重要研究目标，旨在实现更加精准、有效且经济的免疫治疗方案。
技术实现思路
1、(一)要解决的技术问题
2、使用抗体作为免疫靶点tigit阻断剂存在成本昂贵、制备繁琐、室温不稳定、高免疫原性、组织穿透低的问题，在成药和发挥作用方面受到限制。特异性tigit适配体有望代替抗体，实现其分子结合和位点阻断，在调控细胞免疫活性方面具有优势。本专利技术提供了tigit高亲和力核酸适配体及其筛选方法，可用于解决上述问题。
3、(二)技术方案
4、为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：
5、第一方面，本专利技术提供了一种t细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域蛋白(t cell immunoglobulin and itim domain，tigit)的核酸适配体，所述核酸适配体为核酸适配体e1，其序列为：
6、5’-tcaagtcacaggttccaggtcacggagcaccgtgagcgaaggcattgtcctgggaataggcactgacacgacact-3’(如seq id no.1所示)。
7、在25℃，100mm na+，1mm mg2+的条件下，所述核酸适配体e1的空间结构如下：
8、
9、对所述核酸适配体e1的5’端或3’端进行荧光基团、氨基、生物素、地高辛或聚乙二醇化学修饰。
10、对所述核酸适配体e1的5’端修饰fam基团。
11、第二方面，本专利技术提供了所述的核酸适配体在制备检测tigit的试剂、试剂盒或传感器中的应用。
12、所述的核酸适配体在制备样品中tigit的分离富集试剂中的应用。
13、所述的核酸适配体在制备tigit位点的阻断剂中的应用。
14、第三方面，本专利技术还提供了一种特异性识别tigit的试剂盒，它包含所述的核酸适配体，即核酸适配体e1。
15、第四方面，本专利技术还提供了一种所述核酸适配体的筛选方法，其包括：利用磁珠-selex技术，以tigit为靶标，通过以下步骤：①随机寡核苷酸初始文库的构建；②正向筛选及负向筛选；③洗脱获得序列；④扩增、分离及纯化形成次级文库；⑤步骤2～4循环多轮；⑥测序并进行聚类分析及结构分析；⑦亲和力及特异性表征。
16、最后筛选出1号全长候选核酸适配体e1经过流式细胞仪鉴定与磁珠固定化的tigit具有良好亲和性和特异性，该核酸适配体e1有望作为tigit位点的阻断剂使用。
17、(三)有益效果
18、本专利技术以tigit为靶标，利用基于磁珠-selex技术从35个碱基随机区段、总长度75个碱基的ssdna文库中，通过8轮筛选过程富集适配体，经测序得到候选适配体的序列信息，从而得到富集程度最高的适配体序列e1；通过流式细胞术验证候选适配体与靶标分子的亲和性，将荧光强度变化趋势拟合到y＝b*x/(kd+x)方程中，计算出了kd值为377nm/l，能够代替抗体特异性识别细胞膜表面tigit。
19、本专利技术提供的tigit适配体可以在体外筛选，筛选的周期短，筛选得到的序列与靶标分子的特异性结合能力强、亲和力较高。未来用于代替tigit抗体，可通过靶向tigit分子调节t细胞、nk细胞功能，为肿瘤免疫治疗提供了新的视角。
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1.一种T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域蛋的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体为核酸适配体E1，其序列为：
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于：在25℃，100mM Na+，1mM Mg2+的条件下，所述核酸适配体E1的空间结构如下：
3.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于：对所述核酸适配体E1的5’端或3’端进行荧光基团、氨基、生物素、地高辛或聚乙二醇化学修饰。
4.根据权利要求3所述的核酸适配体，其特征在于：对所述核酸适配体E1的5’端修饰FAM基团。
5.如权利要求1-4任意一项所述的核酸适配体在制备检测TIGIT的试剂、试剂盒或传感器中的应用。
6.如权利要求1-4任意一项所述的核酸适配体在制备样品中TIGIT的分离富集试剂中的应用。
7.如权利要求1-4任意一项所述的核酸适配体在制备TIGIT位点的阻断剂中的应用。
8.一种特异性识别TIGIT的试剂盒，其特征在于：它包含权利要求1-4任意一项所述的核酸适配体。
【技术特征摘要】
1.一种t细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域蛋的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体为核酸适配体e1，其序列为：
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于：在25℃，100mm na+，1mm mg2+的条件下，所述核酸适配体e1的空间结构如下：
3.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于：对所述核酸适配体e1的5’端或3’端进行荧光基团、氨基、生物素、地高辛或聚乙二醇化学修饰。
4.根据权利要求3所述的核酸适配体，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张胜行，佘毅军，牛会敏，赖晓凤，杨林，符发兴，
申请(专利权)人：中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院，
类型：发明
国别省市：
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