【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细菌检测，尤其是涉及一种用于细菌特异性检测的噬菌体毛细管的制备、保藏及使用方法。
技术介绍
1、食品安全关系人类生命安全与健康，近年来，食源性致病菌污染始终占据食品安全事件首位。食源性致病菌广泛存在于食物链中，在加工、贮藏、流通等各个环节都能通过受污染的各类食物或者饮用水被摄入人体内，从而导致食物中毒、肠道传染病的发生以及畜禽传染病的流行。常见的食源性致病菌主要有单增李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等。而检测技术是制约食源性致病菌安全监管的重要瓶颈，因此，对食源性致病菌快速检测的技术具有迫切的需求。
2、噬菌体在细菌的捕获与识别上具有天然的优势，可以精确到株特异性水准。与抗体和适配体等其他生物受体相比，噬菌体在细菌检测方面的高特异性、高亲和力、高稳定性、成本低等优势，在细菌检测方向有广阔的研究价值和应用前景。现存的细菌鉴定技术面临着成本高、前处理步骤繁琐、开放性操作易受环境和操作人员影响、假阳性等问题无法满足现场快速检测的需求，因此急需一种低成本、低消耗、高效率、速度快、灵敏度高的通用型检测技术，其操作简单，易于掌握，适合不同环境下使用，不易被污染，可用于食源性致病菌的快速特异性检测。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可快速特异性检测细菌的噬菌体毛细管的制备方法、延长噬菌体毛细管保质期的保藏方法及快速准确完成细菌检测的使用方法。
2、本制备方法解决上述问题所采用的技术方案为：一种用于细菌特
3、毛细管前处理：在毛细管内壁上修饰正电荷层；
4、噬菌体修饰毛细管：噬菌体牢固结合在毛细管内壁的正电荷层上。
5、与现有技术相比，本制备方法的优点在于通过毛细管内壁均匀修饰的正电荷层能够使噬菌体牢固均匀结合在毛细管内壁上，且可批量制作。
6、作为优选，所述噬菌体修饰毛细管的具体步骤如下：
7、a1：将1×1010-1×1013cfu·ml-1噬菌体溶液以1.5-3μl/min的流速通入经前处理后的毛细管中，在36-37℃孵育1-1.5h；
8、a2：用ph 7.2-7.6的pbs溶液冲洗经步骤a1处理的毛细管5-10min；
9、a3：用2-2.2wt％的bsa溶液，以1.5-3μl/min的流速通入经步骤a2处理的毛细管中36-37℃孵育1-1.5h；
10、a4：用ph 7.2-7.6的pbs溶液冲洗经过步骤a3处理的毛细管，冲洗时间10-15min；
11、a5：用氮气吹通经步骤a4处理的毛细管。噬菌体溶液的长时间微速流动性，使得噬菌体修均匀饰在毛细管内壁上；并用bsa溶液封闭未被噬菌体修饰的毛细管内壁，以抗干扰，消除假阳性，这是因为大多数菌的表面都带负电荷，会被毛细管内壁上的正电荷吸引结合，导致包括杂菌在内的细菌直接结合在未被封闭的正电荷层上，从而对检测结果产生假阳性干扰。
12、作为优选，所述毛细管前处理的具体步骤如下：
13、s1、将毛细管依次通入丙酮、去离子水、1-1.2mol/l的naoh、去离子水、1-1.2mol/l的hcl、去离子水，进行活化处理，所述活化时间为：丙酮28-32min，去离子水28-32min，氢氧化钠2-2.5h，去离子水28-32min，盐酸1-1.5h，去离子水28-32min；而后通入20mmol/l ph6.5-8.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液处理毛细管内壁，流速0.2-0.5ml/min，冲洗时间1-1.5h；
14、s2、经步骤s1处理后的毛细管，在40-80℃范围内，以10-15μl/min的流速通入2wt％聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)溶液，通入时间4-5h；
15、s3、经步骤s2处理后的毛细管，用氮气分别从毛细管头部和尾部往复吹干；
16、s4、经步骤s3处理后的毛细管，用去离子水冲洗，冲洗时间5-10min。活化处理用于呈现毛细管内壁的羟基，并通过三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液处理，以此增强聚二烯丙基二甲基氯化铵在毛细管内壁的亲和性；再用氮气分别从毛细管头部和尾部往复吹干，避免团聚，使得聚二烯丙基二甲基氯化铵在毛细管内壁形成的正电荷层修饰均匀，有利于噬菌体的紧密结合。
17、本保藏方法解决上述问题所采用的技术方案为：一种如上述制备方法所得的噬菌体毛细管的保藏方法，将经步骤a4处理的毛细管用氮气吹1-3min，所述氮气流速为：3-5m/s，而后置于0-4℃冰箱保存。0-4℃为噬菌体合适保存温度，pbs水膜使毛细管内表面保持湿润状态，使噬菌体状态稳定，即通过水膜低温保存技术，使得噬菌体毛细管的活性保质期可以延长至3个月。
18、本细菌检测的使用方法解决上述问题所采用的技术方案为：一种检测细菌的使用方法，利用上述制备方法所制得的噬菌体毛细管或上述保藏方法所保藏的噬菌体毛细管，检测待测溶液内的细菌。
19、作为优选，具体使用步骤如下：
20、t1：将5mmol/l syto-13绿色荧光核酸溶液，用水稀释至50μmol/l；
21、t2：将50μmol/l的syto-13绿色荧光核酸染色剂水溶液加入到1×107-1×1012cfu·ml-1细菌样品溶液中，染色10-15min；所述syto-13绿色荧光核酸染色剂水溶液与细菌样品溶液的体积比为1﹕9；
22、t3：用所述毛细管通过毛细作用吸取染色后的细菌样品溶液，静置20-30min；
23、t4：用简易的一次性注射装置将ph 7.2-7.6的10mmol/l pbs溶液冲洗经步骤t3处理的毛细管；
24、t5：对经步骤t4处理的毛细管使用便携式荧光激发检测装置或荧光显微镜进行荧光检测。检测操作简便、快捷，可在30min内完成，勿须人员培训；成本低，消耗少，仅需数十至几微升样品量。
25、作为优选，所述细菌为大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌其中的任意一种。针对不同的病原菌，可以通过对应的噬菌体毛细管进行检测，具有通用性。
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1.一种用于细菌特异性检测的噬菌体毛细管的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，
2.根据权利要求1所述的一种用于细菌特异性检测的噬菌体毛细管的制备方法，其特征在于，所述噬菌体修饰毛细管，具体步骤如下：
3.根据权利要求1或2所述的一种用于细菌特异性检测的噬菌体毛细管的制备方法，其特征在于，所述毛细管前处理的具体步骤如下：
4.一种如权利要求2或3所述制备方法所制得的噬菌体毛细管的保藏方法，其特征在于，将经步骤A4处理的毛细管用氮气吹1-3min，所述氮气流速为：3-5m/s，而后置于0-4℃冰箱保存。
5.一种检测细菌的使用方法，其特征在于，利用如权利要求1～3任一项制备方法所制得的噬菌体毛细管或如权利要求4保藏方法所保藏的噬菌体毛细管，检测待测溶液内的细菌。
6.根据权利要求5所述检测细菌的使用方法，其特征在于，具体使用步骤如下：
7.根据权利要求5或6所述检测细菌的使用方法，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌其中的任意一种。
【技术特征摘要】
1.一种用于细菌特异性检测的噬菌体毛细管的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，
2.根据权利要求1所述的一种用于细菌特异性检测的噬菌体毛细管的制备方法，其特征在于，所述噬菌体修饰毛细管，具体步骤如下：
3.根据权利要求1或2所述的一种用于细菌特异性检测的噬菌体毛细管的制备方法，其特征在于，所述毛细管前处理的具体步骤如下：
4.一种如权利要求2或3所述制备方法所制得的噬菌体毛细管的保藏方法，其特征在于，将经步骤a4处理的毛细管用氮气吹1...
【专利技术属性】
技术研发人员：于佩斓，林建原，贾志舰，阮玉芳，吴萃艳，王倩，蒋力豪，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：
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