酶联免疫试剂盒及用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法技术

酶联免疫试剂盒及用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法，它涉及一种试剂盒及其试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法。本发明专利技术解决了现有的牛乳铁蛋白的检测方法存在的检测成本较高、操作复杂的问题。本发明专利技术酶联免疫试剂盒包括酶联板、牛乳铁蛋白标准品、样品稀释液、检测溶液、底物溶液、洗涤液和终止液；本发明专利技术的检测方法主要经过溶液的配制，将抗体结合在酶联板上，封闭酶联板，将标准品、待测样品固定在酶联板上，然后用酶标仪检测光吸收值，并根据检查结果制作标准曲线，然后计算出待检测样品的牛乳铁蛋白血清的含量。本发明专利技术的方法采用了工作液形式，成本低廉，本发明专利技术的酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白含量的方法操作简单。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种试剂盒及其试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法。
技术介绍
牛乳铁蛋白是牛乳及其制品中重要的功能蛋白之一，在我国牛乳和乳制品的消费正逐年 加大，有人提出应强化牛乳铁蛋白在乳制品、营养保健品和药品中的应用。现有的牛乳铁蛋 白的检测方法主要有酶联免疫法、高效液相色谱法和放射免疫法，但是现有的这些牛乳铁蛋 白的检测方法对检査设备的要求较高，造成了检测成本较高，操作复杂的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有的牛乳铁蛋白的检测方法存在的检测成本较高，操作复杂 的问题，而提供了一种。本专利技术的酶联免疫试剂盒包括酶联板、牛乳铁蛋白标准品、样品稀释液、检测溶液、底 物溶液、洗涤液和终止液；其中，酶联板为96孔酶联板；样品稀释液中NaCl的浓度为 150mmol/L、腿2 04的浓度为1. 6mmol/L、化2冊04的浓度为9. 0mmol/L、 KC1的浓度为 2.6mmol/L，样品稀释液的pH值为7. 4;检测溶液为HRP标记的鼠抗牛乳铁蛋白IgG;底物溶液 是浓度为lg/L的杂环吖嗪溶液；洗涤液中NaCl的浓度为150mmol/L、腿2 04的浓度为 1.6mmol/L、化2冊04的浓度为9. 0mmol/L、 KC1的浓度为2. 6mmol/L、吐温20的质量浓度为 1.25%，洗涤液的pH值为7.4;终止液中乙二胺四乙酸的浓度是O. lmmol/L、 HF的浓度是 0. 15mol/L禾口Na0H的浓度是6mmol/L本专利技术用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法按照以下步骤进行 一、配制溶液检 测溶液用样品稀释液稀释1000倍得到检测稀释液，底物溶液和质量浓度为O. 3%的&02按照1 :l的比例混合得到底物混合液，洗涤液用去离子水稀释25倍得到洗涤稀释液；二、将抗体 结合在酶联板上兔抗牛乳铁蛋白血清用样品稀释液稀释5 20倍得到兔抗牛乳铁蛋白血清 稀释液，然后在酶联板上的每个孔中加入100uL兔抗牛乳铁蛋白血清稀释液，再将酶联板放 置在4。C条件下过夜，即将兔抗牛乳铁蛋白血清结合在酶联板上；三、洗涤稀释液清洗有兔 抗牛乳铁蛋白血清的酶联板3 4次，然后向酶联板上的每个孔中加入200yL的封闭液，再将 酶联板放置于25°C无光照条件下反应45min，其中封闭液由牛血清白蛋白溶液与样品稀释液 按照l: 99的体积比组成；四、在步骤三处理后的酶联板上标注出空白孔、标准品孔和待测样品孔，然后向空白孔中加入100y L的样品稀释液，向标准品孔中加入牛乳铁蛋白标准品的 梯度稀释液，向待测样品孔中加入100uL的待测样品，然后将酶联板置于37'C条件下孵育 2h，然后用洗涤稀释液清洗酶联板3 4次；其中所述的牛乳铁蛋白标准品的梯度稀释液最高 浓度为100 y g/L，用样品稀释液按O. 2 0. 8倍稀释4 10个浓度的牛乳铁蛋白标准品梯度稀 释液；五、向酶联板上的每个孔中加入200yL的检测稀释液，然后将酶联板置于37。C条件下 孵育lh，然后用O. 5 lmL的洗涤稀释液清洗酶联板3 4次后，在酶联板上的每个孔中加入 200uL的底物混合液，将酶联板放置于25。C无光照条件下反应，再向酶联板上的每个孔中加 入50yL的终止液；六、用酶标仪检测出酶联板上的每个孔中的光吸收值，酶标仪的检测波 长为410nm;七、制作标准曲线标准曲线是以LogC对B进行作图，标准曲线中的横坐标B二OD 标准一OD空白，LogC=Log (牛乳铁蛋白标准品梯度稀释液的浓度)，OD标准表示牛乳铁蛋白标准 品的梯度稀释液光吸收值，OD空白表示空白孔的光吸收值；八、待测样品的光吸收值与标准 曲线进行对照，计算出牛乳铁蛋白的含量，即实现了牛乳铁蛋白的检测。本专利技术中所述的兔抗牛乳铁蛋白血清的制备方法为将弗氏完全佐剂置于玛瑙研钵中， 再向玛瑙研钵中加入占弗氏完全佐剂质量1% 10%的、浓度为O. 8 1. 2mg/mL的牛乳铁蛋白标 准品溶液，研磨3 30min，即得到疫苗，然后在每只家兔的后脚掌注射l. 2mg的疫苗，14天 后在每只家兔的皮下多点注射lmg的疫苗，20天后再在家兔的皮下多点注射lmg的疫苗，然后 对家兔进行试血检测效价，直至效价达到l: 80000 90000时在家兔的颈动脉采血，分离出 血清即为兔抗牛乳铁蛋白血清。本专利技术酶联免疫试剂盒为工作液形式，原料价格低廉，且本专利技术方法对实验设备要求低 ，极大的降低了检测成本，与现有的牛乳铁蛋白的检测方法相比，本专利技术的检测成本降低了 50%左右，本专利技术用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法使用方便，操作简单；本专利技术的 检测结果显示乳铁蛋白的最小检出量为0.8yg/L，本专利技术的检査方法灵敏度高。本专利技术的检 测方法可同时用于多个样本进行检测，适合于现场査验及对大量样本的筛査。附图说明图1为具体实施方式十一 中的标准曲线图。 具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式酶联免疫试剂盒包括酶联板、牛乳铁蛋白标准品、样品稀 释液、检测溶液、底物溶液、洗涤液和终止液；其中，酶联板为96孔酶联板；样品稀释液中NaCl的浓度为150mmol/L、腿2 04的浓度为1. 6mmol/L、化2冊04的浓度为9. 0mmol/L、 KC1的浓 度为2.6mmol/L，样品稀释液的pH值为7. 4;检测溶液为HRP标记的鼠抗牛乳铁蛋白IgG;底物 溶液是浓度为1 g/L的杂环吖嗪溶液；洗涤液中NaC 1的浓度为150mmo 1 /L、 KH2P04的浓度为 1.6mmol/L、 Na2HP04的浓度为9. 0mmol/L、 KC1的浓度为2. 6mmol/L、吐温20的质量浓度为 1.25%，洗涤液的pH值为7.4;终止液中乙二胺四乙酸的浓度是O. lmmol/L、 HF的浓度是 0. 15mol/L禾口Na0H的浓度是6mmol/L。本实施方式中的HRP标记的鼠抗牛IgG可从市场上购买得到。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一不同的是本实施方式酶联免疫试剂盒还 包括兔抗牛乳铁蛋白血清。其它与具体实施方式一相同。本实施方式兔抗牛乳铁蛋白血清的制备方法为将弗氏完全佐剂置于玛瑙研钵中，再向 玛瑙研钵中加入占弗氏完全佐剂质量1% 10%的、浓度为O. 8 1. 2mg/mL的牛乳铁蛋白标准品 溶液，研磨3 30min，即得到疫苗，然后在每只家兔的后脚掌注射l. 2mg的疫苗，14天后在 每只家兔的皮下多点注射lmg的疫苗，20天后再在家兔的皮下多点注射lmg的疫苗，然后对家 兔进行试血检测效价，直至效价达到l: 80000 90000时在家兔的颈动脉采血，分离出血清 即为兔抗牛乳铁蛋白血清。具体实施方式三本实施方式用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法按照以下步骤进 行 一、配制溶液检测溶液用样品稀释液稀释1000倍得到检测稀释液，底物溶液和质量浓 度为O. 3%的&02按照1: l的比例混合得到底物混合液，洗涤液用去离子水稀释25倍得到洗涤 稀释液；二、将抗体结合在酶联板上兔抗牛乳铁蛋白血清用样品稀释液稀释5 20倍得到 兔抗牛乳铁蛋白血清稀释液，然后在酶联板上的每个孔中加入100y L兔抗牛乳铁蛋白血清本文档来自技高网...

【技术保护点】
酶联免疫试剂盒，其特征在于酶联免疫试剂盒包括酶联板、牛乳铁蛋白标准品、样品稀释液、检测溶液、底物溶液、洗涤液和终止液；其中，酶联板为９６孔酶联板；样品稀释液中ＮａＣｌ的浓度为１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］的浓度为１．６ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］的浓度为９．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ的浓度为２．６ｍｍｏｌ／Ｌ，样品稀释液的ｐＨ值为７．４；检测溶液为ＨＲＰ标记的鼠抗牛乳铁蛋白ＩｇＧ；底物溶液是浓度为１ｇ／Ｌ的杂环吖嗪溶液；洗涤液中ＮａＣｌ的浓度为１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］的浓度为１．６ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］的浓度为９．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ的浓度为２．６ｍｍｏｌ／Ｌ、吐温２０的质量浓度为１．２５％，洗涤液的ｐＨ值为７．４；终止液中乙二胺四乙酸的浓度是０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＦ的浓度是０．１５ｍｏｌ／Ｌ和ＮａＯＨ的浓度是６ｍｍｏｌ／Ｌ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张英华，生庆海，刘鹏，诸晓强，迟涛，韩秀娥，沈阳，
申请(专利权)人：黑龙江省乳品工业技术开发中心，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]