【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物细胞培养，具体涉及一种长江江豚皮肤永生化细胞系的制备方法。
技术介绍
1、长江江豚(neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis)属于鼠海豚科，是一种生活在长江流域的淡水鲸类动物，是iucn3.1划定的极危(critically endangered,cr)物种，目前为国家一级重点保护野生动物。长江江豚的野生个体数量稀少，根据2022年的考察结果，长江江豚的现存数量大致在1200头左右。由于长江江豚是有着极其重要保护意义的长江生态系统的旗舰物种，其种群受到严格的法律保护，对其进行生物学研究存在诸多限制，其体外培养的细胞是珍贵的种质资源和科学研究对象，因此，迫切需要一种能够在最大限度减少对长江江豚动物个体的伤害的情况下，采集样品并稳定培养的方法。对于多种野生动物，其皮肤细胞可作为易得、优质的种质资源进行冷冻保存和开展相关生物学研究。如何进行这样的体外培养和建立合乎研究、使用标准的永生化细胞系是摆在所有鲸类动物研究人员面前的普遍而重要的科学问题。然而，鲸类动物的成体细胞的原代培养面临以下技术难点：1.鲸类细胞来源于水生的，活体或者死亡的动物的组织，这些动物几乎不可能是相对清洁、无污染的实验动物(鲸类目前并不存在模式实验动物)，其生活的环境，无论是天然水体中还是海洋馆等环境中，不可避免地存在各种微生物，包括一些抗药性较高或者能够抵抗大多数抗生素的水生真菌、其他真核单细胞生物等。而体外细胞培养中防止污染是最重要的前提，细菌及真菌污染直接导致细胞培养失败。2.鲸类动物活体采样后，
2、对于长江江豚的皮肤细胞和其他类型细胞的培养，过往已有文献记录，但是这些研究较为初步，年代较早，也没有详细描述采样处理后的操作过程细节和进行建议，可能会因细节处理不当，或者实验条件准备得不合适而导致培养失败，使极其珍贵的动物样品遭到浪费进而影响科研进度。
技术实现思路
1、为了解决长江江豚的皮肤细胞培养难以形成系统性的技术方案的问题，本专利技术提供了一种新的长江江豚细胞的培养以及永生化方法。该方法操作可行性高，成功率极大。本专利技术对既往部分模糊的操作细节进行了进一步明确，对细胞培养基配方、培养方法进行了改进，特别是采用了在细胞中能够更为稳定地遗传和保持的包装含有sv40gp6(即sv40larget或称sv40t)抗原的慢病毒感染的方式，建立了新的，可以连续传代培养而不发生衰老的细胞系。
2、本专利技术针对现有技术的不足，提供一种长江江豚皮肤永生化细胞系的制备方法。
3、为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
4、本专利技术提供了一种长江江豚皮肤永生化细胞系的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
5、(1)配置长江江豚皮肤细胞的完全培养基；
6、所述完全培养基由dmem/f12完全培养基、胎牛血清、三抗抗生素和成纤维细胞生长因子组成；
7、在本专利技术中，所述细胞生长因子添加量优选为5～20ng/ml，最优选为10ng/ml；
8、(2)长江江豚皮肤细胞样品的处理；
9、(3)长江江豚原代皮肤细胞的培养；
10、(4)长江江豚皮肤细胞的永生化；
11、1)利用载体构建法制备慢病毒；
12、所述制备得到的慢病毒的病毒滴度＞107tu/ml，≤1010tu/ml；
13、2)皮肤细胞的传代；
14、3)长江江豚皮肤细胞的慢病毒感染；
15、当经过传代的细胞的密度为50～60％时进行永生化处理；
16、以10～100的moi值感染经过传代的细胞：计算moi值之后定量获取慢病毒，将含有经过传代的细胞的容器中的旧培养基全部吸出，加入不含抗生素的完全培养基中并加入慢病毒；
17、加入慢病毒后的细胞应恒温培养16小时，待慢病毒感染经过传代的细胞后吸出含有慢病毒的培养基并加入足量酒精确保慢病毒失活，即完成永生化处理得到经过永生化处理的细胞；
18、在本专利技术中，所述moi值感染优选为20；
19、4)长江江豚永生化皮肤细胞的筛选；
20、经过连续培养十代经过永生化处理的细胞之后，原代细胞衰老死亡，得到永生化细胞。
21、在本专利技术中，所述步骤(2)中长江江豚皮肤细胞样品的处理包括以下步骤：
22、将长江江豚皮肤细胞样品置于含有试剂a的离心管中，进行涡旋震荡；
23、涡旋震荡结束后将离心管移至超净工作台内，将样品放入培养皿a中；
24、在培养皿a中利用75％酒精涮洗样品，涮洗结束后将经过涮洗的样品置于培养皿b中，在培养皿b中倒入完全培养基，并去除残留的脂肪、血管组织和样品的外周部分得到经过处理的皮肤细胞样品；
25、再次利用75％酒精在培养皿c中涮洗经过处理的皮肤细胞样品，将经过处理的皮肤细胞样品再次置于含有完全培养基的培养皿d中浸泡，浸泡结束后取出经过处理的皮肤细胞样品以镊子和剪刀进行悬空操作，将洗经过处理的皮肤细胞样品处理成1mm3的皮肤碎块；
26、将皮肤碎块置于培养皿e中与完全培养基混合得到混合物(该混合物实质上为培养基浸湿的皮肤碎块)，将混合物均匀等距接种于t25细胞培养瓶底部，将其翻转后再倾斜加入5ml完全培养基；将培养瓶瓶底面朝上置于37℃，co2浓度为5％，饱和湿度的恒温培养箱中，静置6小时进行固定。
27、所述试剂a为75％酒精或工作浓度的青霉素-链霉素-两性霉素三抗的hbss缓冲溶液；
28、所述涡旋震荡的时间为50s～70s；在本专利技术的实际操作中，如样品量大时，更推荐以75％酒精涡旋震荡。
29、在本专利技术中，所述步骤(3)中长江江豚原代皮肤细胞的培养包括以下步骤：
30、固定完毕后，将培养瓶以极慢速度轻轻翻转回正常底面朝下的状态并开始细胞培养；
31、所述细胞培养的条件为37℃，5％co2浓度和饱和湿度；
32、当培养时间为17～22天，少量细胞从组织块周围爬出并保持贴壁生长，待细胞爬出时，每2天换一次液；
33、当细胞形成单层细胞时可视为能够进行传代处理的状态。
34、在本专利技术中，所述步骤(4)中长江江豚皮肤细胞的永生化中还包括皮肤细胞的传代的操作；
35、所述皮肤细胞的传代包括以下步骤：在生物安全柜中使用胰酶消化皮肤细胞，以hbss溶液涮洗清除残余培养基，在t25培养瓶中培养的细胞加入2ml胰酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种长江江豚皮肤永生化细胞系的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中长江江豚皮肤细胞样品的处理包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中长江江豚原代皮肤细胞的培养包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中长江江豚皮肤细胞的永生化中还包括皮肤细胞的传代的操作；
【技术特征摘要】
1.一种长江江豚皮肤永生化细胞系的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中长江江豚皮肤细胞样品的处理包括以下步骤：
3.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：张皓博，郝玉江，欧阳刚，唐斌，周昊杰，戈潘缘元，寇章兵，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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