【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及mrna疫苗的构建领域，尤其涉及一种针对ⅰ型和ⅱ型登革病毒多靶点mrna疫苗的构建方法。
技术介绍
1、登革病毒属于黄病毒科，黄病毒属，为单股正链rna病毒，主要由白纹伊蚊和埃及伊蚊传播，主要引起登革热、登革出血热和登革休克综合征。登革病毒根据抗原性分为不同的血清型(denv-ⅰ、-ⅱ、-ⅲ和-ⅳ)。该病毒只有一个开放阅读框(orf)，被翻译成多聚体蛋白质，在宿主蛋白酶和病毒蛋白酶的催化下被切割成3种结构蛋白和7种非结构蛋白，并发挥各自的作用。
2、编码蛋白的顺序为5'-c-prm-e-ns1-ns2a-ns2b-ns3-ns4a-ns4b-ns5-3'。其中，e蛋白为包膜蛋白，主要由三个不同的结构域(edⅰ、edⅱ和edⅲ)组成。ed-ⅰ和ed-ⅱ区域产生的中和抗体大多无中和活性且与其它黄病毒间存在广泛的交叉反应，ed-ⅲ区位于融合e蛋白的c端，该区在结构上相对保守，具有免疫球蛋白样β-桶结构，在病毒与宿主细胞的识别和融合过程中发挥重要作用，同时也是病毒诱导中和抗体的关键位点。因此是denv疫苗和治疗性抗体研究的主要靶点。
3、目前，由于denv具有高遗传性、变异性和感染denv后会出现抗体依赖性感染增强等特性，疫苗研发面临诸多困难。理论上，疫苗接种是预防登革热感染最有效的策略，理想的登革热疫苗必须具有对所有四种血清型均衡的保护作用、持续的效力和可靠的安全性。目前，只有(tak003)疫苗在一些国家获批临床，我国尚无获得批准使用的登革热疫苗。
4、本专利技术设计了一种多靶点mr
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种针对ⅰ型和ⅱ型登革病毒多靶点mrna疫苗的构建方法。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采取了如下技术方案：
3、一种针对ⅰ型和ⅱ型登革病毒多靶点mrna疫苗的构建方法，包括以下步骤：
4、s1：将线性化的dna进行体外转录：
5、使用all in one高效mrna合成试剂盒进行体外转录；
6、s2：进行mrna纯化：
7、在室温下，使用mega clear transcription clean-up kit试剂盒纯化，离心；
8、s3：进行mrna含量测定及鉴别：
9、s31：进行mrna含量测定：使用超微量分光光度计检测产物浓度并记录；
10、s32：进行mrna琼脂糖电泳鉴别；
11、s33：判断纯化产物是否符合合格的标准。
12、优选的，所述步骤s1具体包括以下步骤：
13、s11：反应体系配制：按照如下先后顺序添加与配制ivt反应体系；
14、
15、s12：按照上述反应体系混匀后，瞬时离心并置于pcr仪，37℃反应4h；
16、s13：每20μl反应体系中加入2μl dnasei，37℃反应15min。
17、优选的，所述步骤s2具体包括以下步骤：
18、s21：将所述s1反应样品用elution buffer补齐至100μl，用吸头轻轻混匀；
19、s22：加入350μl binding buffer，轻轻混匀；
20、s23：加入250μl 100％乙醇，轻轻混匀；
21、s24：将所述s23的样品轻轻加入至过滤柱中，14000g离心1min，弃去滤液；
22、s25：加入550μl washing buffer，洗涤2次，每次14000g离心1min，弃去滤液；
23、s26：将空的rna微型吸附柱在室温下14000g离心2min；
24、s27：加入50～100μl rnase free water，静置10min后，14000g离心2min；
25、s28：将溶解的mrna转移至新的1.5ml离心管中，充分混匀并做好标记，取出0.3ml用于含量测定及鉴别，其余保存在-20℃用于后续实验。
26、优选的，所述步骤s32具体包括以下步骤：
27、s321：制备电泳液：将50×tae buffer用超纯水配置成1×tae buffer；
28、s322：制备待检测样品：吸取mrna100～300ng，加入同体积的loading buffer，pcr仪70℃反应5min；
29、s323：mrna经1％琼脂糖凝胶电泳后，进行成像，通过marker确认样品条带大小是否正确。
30、优选的，所述步骤s33中，进行nanodrop检测，当260/280的比值在1.8-2.3之间，260/230≧2.0，质量合格。
31、优选的，所述s323中，琼脂糖凝胶电泳条带大小与目的条带大小一致，条带清晰，无明显弥散。
32、本专利技术相对于现有技术取得了以下技术效果：
33、1.本专利技术安全性好：其不存在减毒活疫苗"毒力返祖"或在部分个体中诱发严重疾病的情况，此外，mrna会被正常的细胞过程降解，其体内的半衰期可以通过使用各种修饰和递送方法进行调节；
34、2.本专利技术有效性强：各种修饰使mrna更加稳定和高效的翻译，同时避免抗载体免疫反应；
35、3.本专利技术生产效率高，由于其体外转录反应的高产率，mrna具有快速、低成本和可扩展制造的潜力。
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1.一种针对Ⅰ型和Ⅱ型登革病毒多靶点mRNA疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种针对Ⅰ型和Ⅱ型登革病毒多靶点mRNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种针对Ⅰ型和Ⅱ型登革病毒多靶点mRNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的一种针对Ⅰ型和Ⅱ型登革病毒多靶点mRNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤S32具体包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的一种针对Ⅰ型和Ⅱ型登革病毒多靶点mRNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤S33中，进行Nanodrop检测，当260/280的比值在1.8-2.3之间，260/230≧2.0，质量合格。
6.根据权利要求4所述的一种针对Ⅰ型和Ⅱ型登革病毒多靶点mRNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述S323中，琼脂糖凝胶电泳条带大小与目的条带大小一致，条带清晰，无明显弥散。
【技术特征摘要】
1.一种针对ⅰ型和ⅱ型登革病毒多靶点mrna疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种针对ⅰ型和ⅱ型登革病毒多靶点mrna疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤s1具体包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种针对ⅰ型和ⅱ型登革病毒多靶点mrna疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤s2具体包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的一种针对ⅰ型和ⅱ型登革病毒多靶点mrna疫苗的构建方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：金宁一，鲁会军，于宁，张赫，李霄，陈士刚，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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