【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和生物工程，具体地说，是关于一种高活性人ssx1蛋白的制备方法及其应用。
技术介绍
1、恶性肿瘤已严重影响生命健康。大量研究表明，多数肿瘤组织具有区别于正常组织的肿瘤抗原,肿瘤抗原有望用作肿瘤疫苗的免疫原、免疫治疗的靶点、早期筛查或诊断及预后的生物标志物。这些抗原中，癌-睾丸抗原(cancer-testis antigens，即ct抗原)被证明具有广泛的免疫原性，是一类在多种肿瘤组织中表达而在正常组织中除睾丸外不表达的抗原。
2、人滑膜肉瘤x断裂点(synovial sarcoma x breakpoint,ssx)是常见的癌-睾丸抗原，ssx家族包含十种高度同源的蛋白质，人肉瘤中ssx1表达最为高频。ssx1基因位于人染色体xp11.23-p11.22，编码188个氨基酸，组成的蛋白质分子量约22kda。ssx1在多种人类癌细胞中表达，包括但不限于，纤维肉瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌及慢性骨髓瘤细胞白血病，但正常组织中仅睾丸中有表达。ssx1蛋白作为上述多种癌症的靶点，不但可以作为上述疾病诊断的标记物，还可用于产生上述疾病的预防试剂和/或治疗剂，如抗体或t细胞受体。诊断试剂(如自身抗体检测试剂)、预防试剂或治疗剂(如疫苗)均依赖于高纯度、高免疫活性的ssx1蛋白。
3、本领域目前在生产上应用的大肠杆菌基因工程菌几乎都是诱导型表达系统，通过温度诱导、化学诱导剂等诱导外源蛋白的表达，存在一些不利之处，例如：添加价格昂贵的诱导剂加大了生产成本，诱导后短时间内产生大量的外源蛋白
4、尽管组成型大肠杆菌基因工程菌可以一定程度地克服上述部分缺点，可降低成本且防止外源蛋白形成包涵体，但是组成型大肠杆菌基因工程菌中含有质粒的细胞与失去质粒的细胞相比，过重的代谢负担使得二者的比生长速率相差很大，极易导致培养过程中丢失质粒的细胞成为优势群体，质粒稳定性下降，产量降低。由于组成型大肠杆菌基因工程菌发酵过程优化比较困难，本领域人员一般认为组成型表达系统不适合用于工业规模生产。
5、此前，通常采用lb培养基培养大肠杆菌、iptg诱导表达、8m尿素溶解包涵体、亲和纯化、蛋白复性及酶切去除融合标签的方式制备ssx1蛋白。然而，此类培养时需多次测定菌体丰度以确保在适宜时间加入诱导剂，而诱导剂具有毒性导致菌体生长速度减缓、培养产物细菌丰度上限偏低。包涵体中ssx1蛋白的纯化往往经过高浓度变性剂处理完全失去天然形态，需要后续烦琐的复性步骤才能恢复部分蛋白生物学活性，但是复性步骤工作量很大、复性产率偏低，经常成为提高蛋白产率的瓶颈。蛋白复性后酶切去除融合标签进一步提高了外源蛋白的生产成本。
6、由于iptg不被代谢，在胞内专一诱导外源蛋白的表达。不受细胞代谢的影响，诱导效果持续稳定；由于iptg对于人体具有潜在的毒性，当利用iptg诱导表达应用于人体的重组药物时，对最终的产品带来不利影响。另一方面，iptg的价格也较为昂贵，尤其是在较大体积的发酵罐中进行诱导时，iptg的应用会造成发酵成本的增加。尤其是，当制备“重组人”蛋白、且用于与人用相关的免疫用蛋白(抗原疫苗)，出于配合临床所需，iptg的毒性问题是应该尽量避免的。
7、因此，本领域需要进一步优化ssx1蛋白的重组表达及纯化策略，以期实现高效、低损失的生产。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种高活性人ssx1蛋白的制备方法及其应用。
2、在本专利技术的第一方面，提供一种重组表达人ssx1蛋白的方法，包括：(1)提供重组大肠杆菌细胞，所述大肠杆菌细胞中包含重组表达盒，该重组表达盒含有人ssx1蛋白编码序列；(2)培养(1)的重组大肠杆菌细胞，从而表达人ssx1蛋白；表达后进行细胞裂解，获得裂解产物；分离包涵体；(3)在高ph下以人ssx1蛋白促溶剂处理(2)的包涵体；以含有人ssx1蛋白促溶剂的高ph溶解缓冲液溶解蛋白；以含有人ssx1蛋白促溶剂的纯化缓冲液纯化，获得活性的人ssx1蛋白纯化产物；其中，所述人ssx1蛋白促溶剂包括：0.1～1％ sarkosyl，10～100mm chaps，10～120mm甘氨酸，所述高ph为ph10.0～13.0。
3、本专利技术中，除非另外说明，所述的“量”或“浓度”为“终浓度”。
4、在一种或多种实施方式中，所述sarkosyl(十二烷基肌氨酸钠)的量为0.2～0.8％(m/v)，如0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.9％。
5、在一种或多种实施方式中，所述chaps(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)的量为15～80mm，如20mm，30mm，40mm，50mm，60mm，70mm，90mm。
6、在一种或多种实施方式中，所述甘氨酸的量为20～100mm，如30mm，40mm，50mm，60mm，70mm，80mm，90mm，110mm。
7、在一种或多种实施方式中，所述高ph为ph10.0～13.0，较佳地如ph10.5、ph11、ph11.5、ph12、ph12.5或ph12.8。
8、在一种或多种实施方式中，所述人ssx1蛋白编码序列通过人工合成的方法制备。
9、在一种或多种实施方式中，所述的重组表达盒位于表达载体中。
10、在一种或多种实施方式中，所述的表达载体是pet表达载体。
11、在一种或多种实施方式中，所述的大肠杆菌细胞是大肠杆菌bl21(de3)。
12、在一种或多种实施方式中，步骤(1)中，利用自诱导培养基培养，所述自诱导培养基不含有化学诱导剂如iptg；较佳地，所述自诱导培养基包括：蛋白胨，酵母提取物，甘油，乳糖，葡萄糖，na2hpo4，nh4cl，kh2po4，na2so4，mgso4。
13、在一种或多种实施方式中，步骤(1)中，首先在37±3℃、较佳地37±2℃、更佳地37±1℃的温度条件下培养；之后，更换为在20±3℃、较佳地20±2℃、更佳地20±1℃的温度条件下培养。
14、在一种或多种实施方式中，步骤(1)中，首先在37±3℃、较佳地37±2℃、更佳地37±1℃的温度条件下培养；在培养2±1小时、较佳地2±0.5小时后，更换为在20±3℃、较佳地20±2℃、更佳地20±1℃的温度条件下培养。
15、在一种或多种实施方式中，步骤(2)中，进行表达后，富集(如通过离心收集)细胞，之后进行细胞裂解。
16、在一种或多种实施方式中，自诱导培养基包括：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，甘油5g/l，乳糖2g/l，葡萄糖0.5g/l，na2hpo4 25mmol/l，nh4cl 50mmol/l本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组表达人SSX1蛋白的方法，包括：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，利用自诱导培养基培养，所述自诱导培养基不含有化学诱导剂如IPTG；较佳地，所述自诱导培养基包括：蛋白胨，酵母提取物，甘油，乳糖，葡萄糖，Na2HPO4，NH4Cl，KH2PO4，Na2SO4，MgSO4。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，首先在37±3℃、较佳地37±2℃、更佳地37±1℃的温度条件下培养；之后，更换为在20±3℃、较佳地20±2℃、更佳地20±1℃的温度条件下培养。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用足以使得细胞裂解的裂解缓冲液处理菌体，使得细胞裂解；较佳地，所述裂解缓冲液包含有效量的：溶菌酶，磷酸盐，氯化钠，咪唑，甘油，TCEP，PMSF；较佳地，所述裂解缓冲液为pH7.5±0.5(较佳地pH7.5±0.3，更佳地pH7.5±0.2或pH7.5±0.1)；
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述高pH溶解缓冲液包括：人SSX1蛋白促溶剂，以及：磷酸盐
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述含有人SSX1蛋白促溶剂的纯化缓冲液包括：人SSX1蛋白促溶剂，以及磷酸盐、氯化钠、咪唑、甘油；较佳地，所述纯化缓冲液为pH7.5±0.5。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人SSX1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；较佳地，所述人SSX1蛋白的编码序列如SEQ ID NO:1所示。
8.权利要求1～7任一所述的方法的应用，用于重组表达人SSX1蛋白，所述人SSX1蛋白具有高免疫活性。
9.一种用于重组表达人SSX1蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
10.权利要求9所述的试剂盒在重组表达人SSX1蛋白中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种重组表达人ssx1蛋白的方法，包括：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，利用自诱导培养基培养，所述自诱导培养基不含有化学诱导剂如iptg；较佳地，所述自诱导培养基包括：蛋白胨，酵母提取物，甘油，乳糖，葡萄糖，na2hpo4，nh4cl，kh2po4，na2so4，mgso4。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，首先在37±3℃、较佳地37±2℃、更佳地37±1℃的温度条件下培养；之后，更换为在20±3℃、较佳地20±2℃、更佳地20±1℃的温度条件下培养。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用足以使得细胞裂解的裂解缓冲液处理菌体，使得细胞裂解；较佳地，所述裂解缓冲液包含有效量的：溶菌酶，磷酸盐，氯化钠，咪唑，甘油，tcep，pmsf；较佳地，所述裂解缓冲液为ph7.5±0.5(较佳地ph7.5±0.3，更佳地ph7.5±0.2或ph7....
【专利技术属性】
技术研发人员：刘浩，王东，李宾，张涛，胡欣，
申请(专利权)人：基因科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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