【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及分离腺相关衣壳的领域，并且涉及一种用于确定适合于将完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳与不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的洗脱条件的方法。进一步公开了用于将完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳与不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的方法，以及阴离子交换色谱材料用于这样的分离的用途。本公开可适用于分离腺相关病毒血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9和aav10)以及其变体的衣壳。
技术介绍
1、腺相关病毒(aav)为无包膜病毒，其具有线性单链dna(ssdna)基因组并且可经工程改造以将dna递送至靶细胞。重组腺相关病毒(raav)载体已成为最通用且最成功的基因疗法递送载体之一。使用病毒载体进行基因疗法的需求在不断增加。为了在疗法中使用aav颗粒作为载体，有必要在转染后纯化病毒颗粒以去除dna等细胞杂质。超速离心是高效的但不可扩展。通常，使用若干过滤步骤和若干色谱步骤来从细胞培养物分离aav颗粒(参见例如，weihong qu等人)。
2、aav载体的治疗功效取决于完整包装感兴趣的遗传物质的病毒颗粒的高百分比。上游表达系统提供完整包装的aav颗粒(含有感兴趣的遗传物质)、空的aav颗粒和部分包装感兴趣的遗传物质的aav颗粒以及杂质的混合物。因此需要在纯化过程中富集完整包装的aav颗粒。然而，关于实现完整包装的和空的腺相关病毒衣壳的高效且可扩展分离，存在若干挑战，诸如：
3、-衣壳(血清型和变体)的巨大
4、-完整包装的衣壳和空的衣壳之间在与纯化相关的若干参数(例如，等电点)方面差异小；
5、-除了完整包装的衣壳和空的衣壳之外，受感染的宿主细胞中还产生部分包装的衣壳变体。有迹象表明，这样的部分包装并因此治疗效果较差的衣壳可以与完整包装的衣壳部分共洗脱。
6、之前已描述了用于将完整包装的衣壳与不完整包装的衣壳分离的方法(参见例如，hejmowski等人)。然而，一直需要纯化策略的进一步优化，以增加下游处理不同腺相关病毒血清型的速度并降低其成本。
技术实现思路
1、本公开的目标是提供一种用于将完整包装的腺相关病毒衣壳与不完整包装的腺相关病毒衣壳分离的改进方法。这通过首先进行用于确定适合于将完整包装的衣壳与不完整包装的衣壳分离的洗脱条件的方法来实现。在本文中，这种方法被称为预筛选方法。接着进行通过在如预筛选方法中确定的第一电导率值下洗脱不完整包装的衣壳，以及通过在如预筛选方法中确定的第二电导率值下洗脱完整包装的衣壳，用于将完整包装的衣壳与不完整包装的衣壳分离的方法。由此获得在完整包装的衣壳和不完整包装的衣壳之间的改进的分辨率，这导致实现具有较高的完整包装的衣壳:不完整包装的衣壳比率的组合物。本公开的关注点是一种用于建立分离方法的精制步骤(亦称为二次纯化或最终纯化)的最佳洗脱条件的预筛选方法。
2、更具体而言，本公开的第一方面涉及所谓的预筛选方法，其是一种用于确定适合于将完整包装遗传物质的腺相关病毒(aav)衣壳与不完整包装遗传物质的aav衣壳分离的洗脱条件的方法，所述方法包括：
3、(a)将包含aav衣壳的液体样品添加到包含表面延伸剂的强或部分强的阴离子交换色谱材料，
4、(b)通过应用包含递增电导率的阶梯梯度的洗脱缓冲液，从色谱材料洗脱aav病毒衣壳，所述电导率每阶梯增加约0.5至约3ms/cm，
5、(c)基于步骤(b)中获得的洗脱曲线，确定电导率或电导率相关参数的第一值，其适合于洗脱不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳，和
6、(d)基于步骤(b)中获得的所述洗脱曲线，确定电导率或电导率相关参数的第二值，其适合于洗脱完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳。
7、甚至更具体而言，预筛选方法是一种用于确定适合于将完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳与不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的洗脱条件的方法，所述方法包括以下步骤：
8、a)将包含纯度为至少90％并且浓度为至少1012个腺相关病毒衣壳/ml的腺相关病毒衣壳的液体样品添加到强或部分强的阴离子交换色谱材料，所述阴离子交换色谱材料包含支持物和用于与腺相关病毒衣壳结合的配体，其中至少5％、例如10％的腺相关病毒衣壳为完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳，
9、其中所述色谱材料包含将所述配体连接至所述支持物的表面延伸剂，其中所述表面延伸剂为聚合物，其中所述聚合物选自：
10、(i)具有天然存在的骨架的聚合物，例如多糖，例如淀粉、纤维素、葡聚糖或琼脂糖；和
11、(ii)具有合成骨架的聚合物，例如聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺或聚乙烯醚；
12、b)通过应用包含递增电导率的阶梯梯度的洗脱缓冲液，从色谱材料洗脱不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳和完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳，所述电导率开始于约0至约5ms/cm，并且每阶梯增加约0.5至约3ms/cm，例如每阶梯增加约1至约2ms/cm，例如每阶梯增加约1.2至约1.5ms/cm，至少达到并包括不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳和完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳已从所述色谱材料洗脱的电导率；
13、c)基于步骤(b)中获得的洗脱曲线，确定电导率或电导率相关参数的第一值，其适合于洗脱不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳，和
14、d)基于步骤(b)中获得的所述洗脱曲线，确定电导率或电导率相关参数的第二值，其适合于洗脱完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳。
15、本公开进一步提供了一种用于将完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳与不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的方法，所述方法包括上述预筛选方法的步骤(a)-(d)，并进一步包括以下步骤：
16、e.将包含纯度为至少90％和浓度为至少1012个腺相关病毒衣壳/ml的腺相关病毒衣壳的液体样品添加到如步骤(a)中定义的色谱材料，其中至少5％、例如10％的腺相关病毒衣壳是完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳，所述液体样品源自步骤(a)的液体样品所源自的细胞培养收获物；
17、f.通过应用具有如步骤(c)中确定的电导率或电导率相关参数的第一值的洗脱缓冲液，洗脱不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳；和
18、g.通过应用具有如步骤(d)中确定的电导率或电导率相关参数的第二值的洗脱缓冲液，洗脱完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳；
19、其中
20、(i)步骤(f)的持续时间是步骤(g)的持续时间的至少3倍、例如4倍，和/或
21、(ii)所述方法包括在步骤(f)和步骤(g)之间的步骤(f’)，其中步骤(f’)包括应用在电导率或电导率相关参数的第一值和第二值之间的另外阶梯洗脱和/或递增电导率梯度，并且步骤(f)和本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于确定适合于将完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳与不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的洗脱条件的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中递增电导率的阶梯梯度是递增盐浓度的阶梯梯度，任选地其中在步骤(c)和(d)中的电导率相关参数是盐浓度。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述盐是亲液盐。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述盐包含(i)选自CO32-、SO42-、S2O32-、H2PO4-、HPO42-、乙酸根-、柠檬酸根-和Cl-的阴离子，和(ii)选自NH4+、K+、Na+和Li+的阳离子；任选地其中所述盐是乙酸钠。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括阶梯梯度的每阶梯添加对应于约1至约10体积的色谱材料的体积的洗脱缓冲液。
6.一种用于将完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳与不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的方法，所述方法包括权利要求1的步骤(a)-(d)，并进一步包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述洗脱
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述盐是亲液盐。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述盐包含(i)选自CO32-、SO42-、S2O32-、H2PO4-、HPO42-、乙酸根-、柠檬酸根-和Cl-的阴离子，和(ii)选自NH4+、K+、Na+和Li+的阳离子；任选地其中所述盐是乙酸钠。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括阶梯梯度的每阶梯添加对应于约1至约10体积的色谱材料的体积的洗脱缓冲液。
11.一种用于将完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳与不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的方法，所述方法包括：
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述色谱材料由以下定义：
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表面延伸剂是葡聚糖；
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述腺相关病毒衣壳是腺相关病毒血清型1(AAV1)、腺相关病毒血清型2(AAV2)、腺相关病毒血清型3(AAV3)、腺相关病毒血清型4(AAV4)、腺相关病毒血清型5(AAV5)、腺相关病毒血清型6(AAV6)、腺相关病毒血清型7(AAV7)、腺相关病毒血清型8(AAV8)、腺相关病毒血清型9(AAV9)或腺相关病毒血清型10(AAV10)或其变体的衣壳；
15.根据权利要求6-10中任一项所述的方法，其中所述色谱材料由式IV定义：
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述色谱材料由式IV定义：
17.阴离子交换色谱材料用于将完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳与不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的用途，所述色谱材料包含支持物、配体和将配体连接至支持物的表面延伸剂，并由式IV定义：
18.根据权利要求17所述的用途，其中通过进行权利要求17的步骤(a)-(d)，并进一步通过进行以下步骤，将完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳与不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳分离：
19.根据权利要求17或18所述的用途，其中权利要求17的步骤(b)的洗脱缓冲液，并且当引用权利要求18时还有权利要求18的步骤(f)和(g)的洗脱缓冲液，包含乙酸钠；
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于确定适合于将完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳与不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的洗脱条件的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中递增电导率的阶梯梯度是递增盐浓度的阶梯梯度，任选地其中在步骤(c)和(d)中的电导率相关参数是盐浓度。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述盐是亲液盐。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述盐包含(i)选自co32-、so42-、s2o32-、h2po4-、hpo42-、乙酸根-、柠檬酸根-和cl-的阴离子，和(ii)选自nh4+、k+、na+和li+的阳离子；任选地其中所述盐是乙酸钠。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括阶梯梯度的每阶梯添加对应于约1至约10体积的色谱材料的体积的洗脱缓冲液。
6.一种用于将完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳与不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的方法，所述方法包括权利要求1的步骤(a)-(d)，并进一步包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含盐，并且在步骤(b)中的递增电导率的阶梯梯度是递增盐浓度的阶梯梯度，任选地其中在步骤(c)、(f)和(g)中的电导率相关参数是盐浓度。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述盐是亲液盐。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述盐包含(i)选自co32-、so42-、s2o32-、h2po4-、hpo42-、乙酸根-、柠檬酸根-和cl-的阴离子，和(ii)选自nh4+、k+、na+和li+的阳离子；任选地其中所述盐是乙酸钠。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其中步骤(b)包...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·哈格纳麦克沃特，JL·马卢瓦塞尔，B·内梅斯，
申请(专利权)人：思拓凡生物工艺研发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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