【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其是指一种酶活性提高的麦芽糖淀粉酶突变体及其筛选方法。
技术介绍
1、麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase，ec 3.2.1.133)，又名生麦芽糖淀粉酶或麦芽糖α-淀粉酶，属于糖苷水解酶gh13家族，可有效水解大分子碳水化合物直链淀粉、麦芽三糖、环状糊精，生成的主要产物为麦芽糖，副产物为葡萄糖，这种产物特性使得麦芽糖淀粉酶在淀粉糖化工业中成为不可或缺的催化剂，对于提升糖化效率、优化糖液组成具有重大意义，在淀粉糖化工业、面粉工业和食品烘焙中具有广泛的应用。
2、近年来，针对麦芽糖淀粉酶的研究已逐步深入，涵盖了从自然环境的广泛筛选、基于酶结构与功能关系的理性设计，到利用现代生物技术手段进行的定向进化等多个方面。这些研究努力不仅提升了麦芽糖淀粉酶的性能，如提高了酶的热稳定性、ph耐受范围以及底物特异性等，还初步揭示了其催化机制的部分奥秘。然而，当前研究仍面临诸多挑战，如传统筛选方法效率低下、理性设计中有效作用位点有限等问题，这些都在一定程度上限制了麦芽糖淀粉酶的高效筛选与定向改造，进而影响了其工业应用的成本效益和酶活力的进一步提升。特别值得一提的是，麦芽糖淀粉酶的热稳定性在工业生产中扮演着至关重要的角色。在淀粉糖化、食品烘焙等高温过程中，酶的热稳定性直接决定了其催化效率和使用寿命。一个具有高热稳定性的麦芽糖淀粉酶能够在较高的操作温度下依然保持较高的催化活性，这不仅提高了生产效率，还减少了因酶失活而需频繁添加新酶的成本。此外，高热稳定性还有助于简化生产工艺流程，减少冷却步骤，进一步降
3、因此，加速产麦芽糖淀粉酶菌株的高效筛选与分子改良，特别是针对酶的热稳定性进行定向优化，已成为当前研究的热点和难点。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种酶活性提高的麦芽糖淀粉酶突变体及其筛选方法，本专利技术以麦芽糖淀粉酶基因为模板，进行易错pcr反应，获得麦芽糖淀粉酶突变体文库；在重组枯草芽孢杆菌中使用pglvc和pamye启动子分别表达荧光蛋白和麦芽糖淀粉酶突变体，并对pglvc位点进行突变使其诱导强度进一步提升。麦芽糖淀粉酶突变体与可溶性淀粉反应生成麦芽糖，在麦芽糖诱导下pglvc启动子表达荧光蛋白。检测反应体系中发酵上清液中荧光强度，从中筛选高活性麦芽糖淀粉酶突变体。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种麦芽糖淀粉酶的高通量筛选方法，包括以下步骤：
3、步骤s1、以麦芽糖淀粉酶基因为模板，进行易错pcr反应，获得麦芽糖淀粉酶突变体文库，所述麦芽糖淀粉酶基因序列如seq id no.1所示；
4、步骤s2、构建第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体使用pglvc启动子表达荧光蛋白，所述第二表达载体使用pamye启动子表达麦芽糖淀粉酶突变体，所述pglvc启动子核苷酸序列如seq id no.2所示；
5、步骤s3、将所述第一表达载体和第二表达载体转入宿主枯草芽孢杆菌中，得到重组枯草芽孢杆菌；
6、步骤s4、在反应体系中添加所述重组枯草芽孢杆菌，以可溶性淀粉为底物，得到发酵上清液，麦芽糖淀粉酶突变体与可溶性淀粉反应生成麦芽糖，在麦芽糖诱导下pglvc启动子表达荧光蛋白；
7、步骤s5、检测发酵上清液中荧光强度，麦芽糖淀粉酶突变体酶活与荧光强度呈正相关，从中筛选高活性麦芽糖淀粉酶突变体。
8、进一步地，步骤s1中，所述易错pcr使用序列如seq id no.3所示的上游引物和序列如seq id no.4所示的下游引物。
9、具体地，所述上游引物序列为tcttcttctgcttctgttaagggtgatg。
10、具体地，所述下游引物序列为ttagtgatggtgatgatggtggttttgc。
11、进一步地，步骤s2中，所述pglvc启动子以如seq id no.2所示核苷酸序列作为出发序列，进行以下任一种突变：
12、(1)第363位鸟嘌呤突变为腺嘌呤；
13、(2)第280位胸腺嘧啶突变为胞嘧啶；
14、(3)第382位胸腺嘧啶突变为胞嘧啶。
15、优选地，所述pglvc启动子以如seq id no.2所示序列作为出发序列，第382位胸腺嘧啶突变为胞嘧啶。
16、进一步地，步骤s2中，所述第二表达载体中，所述麦芽糖淀粉酶突变体上游表达yvce信号肽。
17、进一步地，步骤s3中，所述宿主枯草芽孢杆菌中敲除amye基因。
18、本专利技术的第二个目的是提供由上述高通量筛选方法筛选得到的麦芽糖淀粉酶突变体，所述突变体以seq id no.5为出发序列进行以下任一种突变：
19、(1)第440位谷氨酰胺突变为天冬酰胺；
20、(2)第442位丝氨酸突变为天冬酰胺，第661位谷氨酰胺突变为亮氨酸。
21、本专利技术的第三个目的是提供编码上述麦芽糖淀粉酶突变体的基因。
22、本专利技术的第四个目的是提供一种包含上述基因的表达载体。
23、本专利技术的第五个目的是提供一种包含上述麦芽糖淀粉酶突变体或上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为非植物细胞。
24、本专利技术的第六个目的是提供上述突变体、上述基因、上述表达载体或上述宿主细胞在水解可溶性淀粉中的应用。
25、本专利技术的有益效果：
26、本专利技术提供了一种酶活性提高的麦芽糖淀粉酶突变体的筛选方法，在重组枯草芽孢杆菌中使用pglvc和pamye启动子分别表达荧光蛋白和麦芽糖淀粉酶突变体，其中pglvc经过突变，对麦芽糖的响应范围和诱导强度进一步提升，且不影响菌株生长，可以用于构建麦芽糖响应的生物传感器。通过检测反应体系中发酵上清液中荧光强度即可反映麦芽糖淀粉酶突变体的酶活，从中筛选高活性麦芽糖淀粉酶突变体amymq440n和amyms442n/q661l，突变体较野生型在酶活性、催化效率和热稳定性等方面均得到了明显提升，酶活分别较野生型提高26.24％和24.79％，且在60℃或80℃条件下能够保持一定的稳定性，有利于更广泛地应用于水解淀粉制备麦芽糖。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种麦芽糖淀粉酶的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：步骤S1中，所述易错PCR使用序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物。
3.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤S2中，所述Pglvc启动子以如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列作为出发序列，进行以下任一种突变：
4.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：步骤S2中，所述第二表达载体中，所述麦芽糖淀粉酶突变体上游表达yvcE信号肽。
5.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：步骤S3中，所述宿主枯草芽孢杆菌中敲除amyE基因。
6.由权利要求1-5任一所述高通量筛选方法筛选得到的麦芽糖淀粉酶突变体，其特征在于，所述突变体以SEQ ID NO.5为出发序列进行以下任一种突变：
7.编码权利要求6所述麦芽糖淀粉酶突变体的基因。
8.一种包含权利要求7所述基因的表达载体。
9.一种包含权利要
10.权利要求6所述的突变体、权利要求7所述的基因、权利要求8所述的表达载体或权利要求9所述的宿主细胞在水解可溶性淀粉中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种麦芽糖淀粉酶的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：步骤s1中，所述易错pcr使用序列如seq id no.3所示的上游引物和序列如seq id no.4所示的下游引物。
3.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤s2中，所述pglvc启动子以如seq id no.2所示核苷酸序列作为出发序列，进行以下任一种突变：
4.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：步骤s2中，所述第二表达载体中，所述麦芽糖淀粉酶突变体上游表达yvce信号肽。
5.根据权利要求1所述的高通量筛选...
【专利技术属性】
技术研发人员：张国强，陈坚，王佳元，堵国成，李江华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。