【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于海洋生物细胞培养技术，具体涉及一种南极鱼细胞系构建的方法和应用。
技术介绍
1、南极鱼类通常是指生活在南大洋的鲈形目南极鱼亚目鱼类，能够适应水温常年维持在0℃以下的极端环境的鱼类，南极鱼类在进化过程中发生了一系列细胞、分子和基因组水平上的改变，以适应南极寒冷的环境。由于全球气候变暖，气候变化对南极的生态系统造成了不可逆转的影响，对南极的生物多样性和生态环境造成了严重的威胁。
2、真裸南极鱼(harpagifer antarcticus)，属辐鳍鱼纲，鲈形目，裸南极鱼科，裸南极鱼属，分布于南冰洋海域，栖息深度为0-84公尺，体长可达9.5公分，为底栖性鱼类，属肉食性，个体较小，体色与周围环境相似。真裸南极鱼作为重要的南极鱼类，在了解南极生物资源多样性和适应性进化的研究中备受青睐。
3、鱼类细胞系作为一种体外培养系统，是进行病毒学、毒理学、生理学及分子遗传学等研究的重要基础材料。近年来随着极地勘测和样品获取技术的飞速发展，极地动物生命科学领域的研究也取得了长足进步。揭秘极地动物，特别是渔业动物的基因组结构，发掘功能基因，探究极地动物适应寒冷环境的分子机制，不仅具有重要的科学意义，而且还有重大的应用价值和潜力。
4、然而，目前关于南极鱼细胞系的建立仍处于空白。因此，建立南极鱼细胞系对于进行南极鱼生理学、毒理学及分子遗传学等研究提供了宝贵的材料，对于南极鱼细胞系资源开发及种质资源保存具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术中的缺陷，本
2、为了实现上述目的，本专利技术提出了一种南极鱼鳍细胞系，所述南极鱼鳍细胞的保藏编号为cctcc no：c2024157。
3、需要说明的是，本专利技术所述的南极鱼鳍细胞为真裸南极鱼鳍细胞ha-fin-cell2024，分类命名为真裸南极鱼(harpagifer antarcticus)，保藏在中国典型培养物保藏中心(地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏编号为cctcc no：c2024157，保藏日期为2024年6月20日。
4、此外，本专利技术还提出了一种构建上述的南极鱼鳍细胞系的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
5、步骤s1：采集南极鱼鳍组织，清洁灭菌，剪碎，获得组织块；
6、步骤s2：将组织块放入培养瓶中进行培养，获得原代培养细胞；
7、步骤s3：当原代培养细胞贴壁生长至培养瓶底50％～60％时，吸弃培养瓶中原培养基，用pbs冲洗细胞(例如可以为两次)，加入胰蛋白酶-edta进行消化，待原代培养细胞变圆脱落后，加入细胞完全培养基，使细胞均匀接种在培养瓶中继续生长；
8、步骤s4：当原代培养细胞生长到培养基底面积的85～95％时，吸弃培养瓶中原培养基，用pbs冲洗细胞，加入胰蛋白酶-edta消化液消化，当消化完毕后，向培养瓶中加入细胞完全培养基，收集细胞至离心管中，离心弃上清，用细胞完全培养基重悬，按照1：1的比例均匀将细胞接种，进行传代培养，由此构建完成南极鱼鳍细胞系。
9、优选地，所述胰蛋白酶-edta的质量体积百分比为0.2～0.3％,，优选为0.25％。
10、优选地，在所述步骤s2中，所述培养温度为4℃～12℃。
11、优选地，所述的细胞完全培养基制备方法如下：
12、在l-15基础培养基中添加体积比为5～25％(优选地，可以为20％)的胎牛血清、终浓度为10～15ng/ml bfgf、终浓度为50～60μmol/l 2-me以及终浓度为200～250iu/ml青霉素-链霉素-两性霉素b混合液。
13、另外，本专利技术提出了一种冻存上述的南极鱼鳍细胞系的冻存方法，所述冻存方法包括以下步骤：
14、将南极鱼鳍细胞离心收集细胞沉淀物，用细胞冻存液重悬保存于-80℃保存24～48h，随后放入液氮保存。
15、优选地，所述细胞冻存液包括以下组分，各组分以体积百分数计：
16、10％dmso、10％fbs和80％l-15完全培养基。
17、在一些优选的实施方式中，冻存方法具体操作为：将南极鱼鳍细胞系生长至汇合度为90％左右时进行冷冻保存。吸弃培养瓶中原培养基，用pbs冲洗细胞两次，加入0.25％胰蛋白酶-edta消化液消化3～5min，待细胞基本全部变圆，脱离贴壁状态时加入含有20％fbs的l-15完全培养基终止消化，收集细胞至离心管中，1000r/min离心5min，收集细胞沉淀，用细胞冻存液重悬细胞保存到细胞冻存管中，将细胞冻存管转移到程序性降温盒，在-80℃保存24h后转入液氮长久保存。所述细胞冻存液各成分的体积比：10％dmso，10％fbs和80％l-15完全培养基。
18、再者，本专利技术还提出了一种复苏上述的南极鱼鳍细胞系的复苏方法，所述复苏方法包括以下步骤：
19、将冻存的南极鱼鳍细胞于12℃～15℃进行解冻，当冰晶融化时，离心弃上清，加入细胞完全培养基重悬，得到复苏的细胞。
20、优选地，所述复苏方法还包括步骤：复苏后的细胞于10℃、5％ co2培养箱中培养。
21、在一些优选的实施方式中，所述复苏方法具体操作为：将在液氮中保存的细胞迅速转移到12℃水浴锅中不断轻晃动解冻，当细胞冻存管内的冰晶融化时，1000g离心5min后吸弃上清，加入3ml的l-15完全培养基重悬细胞，接种到25cm2培养瓶中，放置于10℃、5％co2培养箱中进行培养，次日观察细胞生长状态并更换培养基。
22、此外，本专利技术提出了上所述的南极鱼鳍细胞系在以下的应用其中之一：
23、
24、(1)表达外源蛋白；
25、(2)制备表达外源蛋白产品；
26、(3)构建细胞库；
27、(4)基因筛选；
28、(5)功能分析。
29、在一些优选的实施方式中，南极鱼鳍细胞系的构建方法可以采用以下操作步骤：
30、步骤s11：将南极鱼麻醉后，在无菌条件下取南极鱼鳍条组织，将鳍条组织块使用含有5％青霉素-链霉素-两性霉素b的pbs将组织块清洗干净后剪刀将南极鱼鳍条组织剪成1mm3小块，用pbs清洗三次，在组织块中加入适量细胞完全培养基；
31、步骤s12：将组织块均匀接种在培养瓶中，使细胞完全培养基浸没组织块，在10℃，5％ co2培养箱中培养；
32、步骤s13：在初始培养的前15天，每隔3天更换一次培养基，更换的培养基量为原培养基体积的一半；
33、步骤s14：在培养的第17天，细胞贴壁生长至培养瓶底50％～60％时，吸弃培养瓶中原培养基，用pbs冲洗细胞两次，加入胰蛋白酶-edta消化液进行消化，待南极鱼鳍细胞变圆脱本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种南极鱼鳍细胞系，其特征在于，所述南极鱼鳍细胞的编号为CCTCC NO：C2024157。
2.一种构建如权利要求1所述的南极鱼鳍细胞系的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述胰蛋白酶-EDTA的质量体积百分比为0.2～0.3％。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述培养温度为4℃～12℃。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述鱼鳍组织采自南极鱼鳍条。
6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的细胞完全培养基制备方法如下：
7.一种冻存如权利要求1所述的南极鱼鳍细胞系的冻存方法，其特征在于，所述冻存方法包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的冻存方法，其特征在于，所述细胞冻存液包括以下组分，各组分以体积百分数计：
9.一种复苏如权利要求1所述的南极鱼鳍细胞系的复苏方法，其特征在于，所述复苏方法包括以下步骤：
10.如权利要求1所述的南极鱼鳍细胞系在以下
...【技术特征摘要】
1.一种南极鱼鳍细胞系，其特征在于，所述南极鱼鳍细胞的编号为cctcc no：c2024157。
2.一种构建如权利要求1所述的南极鱼鳍细胞系的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述胰蛋白酶-edta的质量体积百分比为0.2～0.3％。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤s2中，所述培养温度为4℃～12℃。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述鱼鳍组织采自南...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈良标，王洁，韩爽，张京平，吴智超，杨继辉，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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