System.ArgumentOutOfRangeException: 索引和长度必须引用该字符串内的位置。 参数名: length 在 System.String.Substring(Int32 startIndex, Int32 length) 在 zhuanliShow.Bind() 使用3'烯丙基封端的核苷酸的测序方法技术_技高网

使用3'烯丙基封端的核苷酸的测序方法技术

技术编号:43610548 阅读:4 留言:0更新日期:2024-12-11 14:55
本公开的实施方案涉及具有3'烯丙基封端基团的核苷酸。本文还提供了使用本文所述的具有3'烯丙基封端基团的核苷酸进行测序的方法以及测序试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】

本公开整体涉及多核苷酸测序方法、组合物和用于测序的试剂盒。本公开还涉及除去3′封端基团的方法。
技术介绍
一直以来,分子研究的进展在某种程度上是由用于表征分子或其生物反应的技术的改进所引起的。特别地,核酸dna和rna研究得益于对用于序列分析的技术的开发以及对杂交事件的研究。已改进核酸研究的技术的一个示例是开发固定化核酸的装配阵列。这些阵列通常由固定到固体载体材料上的多核苷酸的高密度矩阵组成。参见例如,fodor等人,trendsbiotech.12:19-26,1994,其描述了使用化学敏化玻璃表面组装核酸的方法,该化学敏化玻璃表面受掩模保护,但在限定的区域暴露以允许附接经适当修饰的核苷酸亚磷酰胺。装配阵列也可以通过将已知的多核苷酸“点样”到固体载体上的预定位置的技术来制造(例如,stimpson等人,proc.natl.acad.sci.92:6379-6383,1995)。确定与阵列结合的核酸的核苷酸序列的一种方法称为“边合成边测序”或“sbs”。在理想情况下,用于测定dna的核苷酸序列的这种技术需要有控制地(即,每次一个)掺入与正在测序的核酸相反的正确互补核苷酸。这使得能够通过在多个循环中添加核苷酸来准确测序,由于每次只测序一个核苷酸残基,从而防止不受控制地掺入核苷酸序列。使用与掺入的核苷酸附接的适当标记来读取掺入的核苷酸,之后除去该标记部分,并进行随后的下一轮测序。为了确保仅掺入单个核苷酸,在每个标记的核苷酸中包括结构修饰(“保护基团”或“封端基团”),该结构修饰被添加到生长链以确保仅掺入一个核苷酸。在添加具有保护基团的核苷酸后,在不干扰正在测序的dna的完整性的反应条件下除去该保护基团。然后可继续测序循环,掺入下一个受保护的标记核苷酸。为了用于dna测序,核苷酸(通常是核苷酸三磷酸)一般需要3′-羟基封端基团,以便一旦在该核苷酸上添加碱基,就防止用于将其掺入多核苷酸链中的聚合酶继续复制。之前已描述过可逆的保护基团。例如,metzker等人(nucleic acids research,22(20):4259-4267,1994)公开了八种3′-修饰的2-脱氧核糖核苷5′-三磷酸(3′-修饰的dntp)的合成与用途,并在两种dna模板测定中测试了它们的掺入活性。wo 2002/029003描述了一种测序方法,其可以包括在聚合酶反应中使用烯丙基保护基团来对dna生长链上的3′-oh基团封端。此外,之前在国际申请专利公布号wo 2004/018497和wo 2014/139596中报告了对许多可逆保护基团的开发以及在dna相容条件下移除这些保护基团的方法,这两份国际申请公开中的每一者据此全文以引用方式并入。尽管在20年前已经报道了3′烯丙基封端的核苷酸的使用,但是由于包括3′封端基团裂解化学的低效率以及测序期间信号强度的快速损失在内的各种因素,使用此类核苷酸的sbs从未成功地应用于用于长dna读取的商业环境中。例如,ju等人报道了使用3′烯丙基封端的核苷酸的四色dna边合成边测序,并且报道了仅25个循环的sbs,其中仅在五个循环后荧光强度显著损失。参见ju等人,pnas,2006,103(52):19635-19640。因此,仍然需要改进测序条件(例如,3′烯丙基封端基团的裂解条件)和使用具有3′烯丙基封端基团的核苷酸的sbs的测序指标。


技术介绍

0、专利技术背景


技术实现思路

1、本公开的一个方面涉及一种平行确定多个不同的靶多核苷酸的序列的方法,该方法包括:

2、(a)使固体载体与包含测序引物的溶液在杂交条件下接触,其中:

3、(i)该固体载体包含至少5,000,000个在空间上可区分的位点/cm2,该位点包含靶多核苷酸的多个拷贝;

4、(ii)该固体载体包含多个不同的靶多核苷酸;以及

5、(iii)该测序引物与该不同的靶多核苷酸的至少一部分互补;

6、(b)使该固体载体与包含dna聚合酶和核苷酸a、g、c和t或u的水性溶液在适用于dna聚合酶介导的引物延伸的条件下接触,其中每种核苷酸包含具有与3′氧原子附接的3′烯丙基封端基团的2′脱氧核糖部分;

7、(c)使该固体载体成像以确定所掺入的核苷酸的身份;

8、(d)使该固体载体与包含钯催化剂和三(羟烷基)膦的水性解封端溶液在适于从所掺入的核苷酸中化学除去3′烯丙基封端基团从而暴露3′-oh基团以用于在该固体载体上进行进一步核苷酸掺入的条件下接触;

9、(e)使所述固体载体与水性洗涤溶液接触;以及

10、(f)重复步骤(b)至(e)以确定靶多核苷酸序列。

11、本公开的另一方面涉及一种平行确定多个不同的靶多核苷酸的序列的方法,该方法包括:

12、(a)使固体载体与包含测序引物的溶液在杂交条件下接触,其中:

13、(i)该固体载体包含至少5,000,000个在空间上可区分的位点/cm2,该位点包含靶多核苷酸的多个拷贝;

14、(ii)该固体载体包含多个不同的靶多核苷酸;以及

15、(iii)该测序引物与不同的靶多核苷酸的至少一部分互补;

16、(b)使该固体载体与包含dna聚合酶和核苷酸a、g、c和t或u的水性溶液在适用于dna聚合酶介导的引物延伸的条件下接触,其中:

17、(i)至少三种类型的核苷酸中的每一种类型独立地包含经由可裂解接头与可检测标记附接的碱基,并且该可裂解接头包含选自由以下项组成的组的部分:

18、并且*指示该部分与核苷酸的其余部分连接的位置;

19、(ii)每种核苷酸包含具有与3′氧原子附接的3′烯丙基基团的2′脱氧核糖部分;以及

20、(iii)该dna聚合酶是改变的古细菌dna聚合酶;

21、(c)使该固体载体与包含一种或多种自由基清除剂的溶液接触,并且使该固体载体成像以确定所掺入的核苷酸的身份;

22、(d)使该固体载体与包含钯催化剂和三(羟烷基)膦的水性解封端溶液在适于(i)从所掺入的核苷酸中化学除去3′烯丙基封端基团从而暴露3′-oh基团以用于在该固体载体上进行进一步核苷酸掺入;以及(ii)化学除去经由可裂解接头附接的可检测标记的条件下接触;

23、(e)使所述固体载体与包含钯清除剂的水性洗涤溶液接触;以及

24、(f)重复步骤(b)至(e)以确定靶多核苷酸序列。

25、本公开的另一方面涉及一种平行确定多个不同的靶多核苷酸的序列的方法,该方法包括:

26、(a)使固体载体与包含测序引物的溶液在杂交条件下接触,其中:

27、(i)该固体载体包含至少5,000,000个在空间上可区分的位点/cm2,该位点包含靶多核苷酸的多个拷贝;

28、(ii)该固体载体包含多个不同的靶多核苷酸;以及

29、(iii)所述测序引物与所述不同的靶多核苷酸的至少一部分互补;

30、(b)使该固体载体与包含dna聚合本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种平行确定多个不同的靶多核苷酸的序列的方法,所述方法包括:

2.根据权利要求1所述的方法,其中步骤(b)中包含DNA聚合酶的所述水性溶液进一步包含钯清除剂。

3.根据权利要求2所述的方法,其中步骤(b)中的所述钯清除剂是Pd(0)清除剂。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中步骤(e)中的所述水性洗涤溶液进一步包含钯清除剂。

5.根据权利要求4所述的方法,其中步骤(e)中的所述钯清除剂是Pd(II)清除剂。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述水性解封端溶液进一步包含抗坏血酸盐。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中至少一种类型的核苷酸包含经由可裂解接头与可检测标记附接的碱基。

8.根据权利要求7所述的方法,其中所述可检测标记是荧光染料,并且所述可裂解接头选自由以下项组成的组:

9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中至少三种类型的核苷酸包含经由可裂解接头与可检测标记附接的碱基。

10.根据权利要求9所述的方法,其中所述至少三种类型的核苷酸中的每一种类型的核苷酸的所述可检测标记能够与其他可检测标记区分,并且所述可裂解接头选自由以下项组成的组:

11.一种平行确定多个不同的靶多核苷酸的序列的方法,所述方法包括:

12.根据权利要求11所述的方法,其中步骤(e)的所述水性洗涤溶液中的所述钯清除剂是Pd(II)清除剂。

13.根据权利要求11或12所述的方法,其中步骤(b)中包含DNA聚合酶的所述水性溶液进一步包含钯清除剂。

14.根据权利要求13所述的方法,其中步骤(b)中的所述钯清除剂是Pd(0)清除剂。

15.一种平行确定多个不同的靶多核苷酸的序列的方法,所述方法包括:

16.根据权利要求15所述的方法,其中步骤(b)中包含DNA聚合酶的所述水性溶液进一步包含钯清除剂。

17.根据权利要求16所述的方法,其中步骤(b)中的所述钯清除剂是Pd(0)清除剂。

18.根据权利要求16或17所述的方法,其中步骤(e)中的所述水性洗涤溶液进一步包含钯清除剂。

19.根据权利要求18所述的方法,其中步骤(e)中的所述钯清除剂是Pd(II)清除剂。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法,其中所述三(羟烷基)膦是三(羟丙基)膦(THPP)。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法,其中所述固体载体包含至少5,000,000个在空间上可区分的位点/cm2,所述位点包含多联体,所述多联体包含所述靶多核苷酸的多个拷贝。

22.根据权利要求1至20中任一项所述的方法,其中所述固体载体包含至少5,000,000个在空间上可区分的位点/cm2,所述位点包含固定的核酸分子簇,所述固定的核酸分子簇包含所述靶多核苷酸的多个拷贝。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法,其中所述A和G核苷酸的所述碱基是脱氮嘌呤。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法,其中所述T核苷酸具有以下结构:

25.根据权利要求24所述的方法,其中所述T核苷酸具有以下结构:

26.根据权利要求24或25所述的方法,其中所述T核苷酸具有以下结构:

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法,其中所述A核苷酸具有以下结构:

28.根据权利要求27所述的方法,其中所述A核苷酸具有以下结构:

29.根据权利要求27或28所述的方法,其中所述A核苷酸具有以下结构:

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法,其中所述C核苷酸具有以下结构:

31.根据权利要求30所述的方法,其中所述C核苷酸具有以下结构:

32.根据权利要求30或31所述的方法,其中所述C核苷酸具有以下结构:

33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法,其中所述G核苷酸具有以下结构:

34.根据权利要求33所述的方法,其中所述G核苷酸具有以下结构:

35.根据权利要求33或34所述的方法,其中所述G核苷酸具有以下结构:

36.根据权利要求1至22中任一项所述的方法,其中至少一种类型的核苷酸具有选自由以下项组成的组的结构:

37.根据权利要求36所述的方法,其中至少一种类型的核苷酸具有选自由以下项组成的组的结构:

38.一种平行确定多个不同的靶多核苷酸的序列的方法,所述方法包括:

39.根据权利要求38所...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

1.一种平行确定多个不同的靶多核苷酸的序列的方法,所述方法包括:

2.根据权利要求1所述的方法,其中步骤(b)中包含dna聚合酶的所述水性溶液进一步包含钯清除剂。

3.根据权利要求2所述的方法,其中步骤(b)中的所述钯清除剂是pd(0)清除剂。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中步骤(e)中的所述水性洗涤溶液进一步包含钯清除剂。

5.根据权利要求4所述的方法,其中步骤(e)中的所述钯清除剂是pd(ii)清除剂。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述水性解封端溶液进一步包含抗坏血酸盐。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中至少一种类型的核苷酸包含经由可裂解接头与可检测标记附接的碱基。

8.根据权利要求7所述的方法,其中所述可检测标记是荧光染料,并且所述可裂解接头选自由以下项组成的组:

9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中至少三种类型的核苷酸包含经由可裂解接头与可检测标记附接的碱基。

10.根据权利要求9所述的方法,其中所述至少三种类型的核苷酸中的每一种类型的核苷酸的所述可检测标记能够与其他可检测标记区分,并且所述可裂解接头选自由以下项组成的组:

11.一种平行确定多个不同的靶多核苷酸的序列的方法,所述方法包括:

12.根据权利要求11所述的方法,其中步骤(e)的所述水性洗涤溶液中的所述钯清除剂是pd(ii)清除剂。

13.根据权利要求11或12所述的方法,其中步骤(b)中包含dna聚合酶的所述水性溶液进一步包含钯清除剂。

14.根据权利要求13所述的方法,其中步骤(b)中的所述钯清除剂是pd(0)清除剂。

15.一种平行确定多个不同的靶多核苷酸的序列的方法,所述方法包括:

16.根据权利要求15所述的方法,其中步骤(b)中包含dna聚合酶的所述水性溶液进一步包含钯清除剂。

17.根据权利要求16所述的方法,其中步骤(b)中的所述钯清除剂是pd(0)清除剂。

18.根据权利要求16或17所述的方法,其中步骤(e)中的所述水性洗涤溶液进一步包含钯清除剂。

19.根据权利要求18所述的方法,其中步骤(e)中的所述钯清除剂是pd(ii)清除剂。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法,其中所述三(羟烷基)膦是三(羟丙基)膦(thpp)。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法,其中所述固体载体包含至少5,000,000个在空间上可区分的位点/cm2,所述位点包含多联体,所述多联体包含所述靶多核苷酸的多个拷贝。

22.根据权利要求1至20中任一项所述的方法,其中所述固体载体包含至少5,000,000个在空间上可区分的位点/cm2,所述位点包含固定的核酸分子簇,所述固定的核酸分子簇包含所述靶多核苷酸的多个拷贝。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法,其中所述a和g核苷酸的所述碱基是脱氮嘌呤。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法,其中所述t核苷酸具有以下结构:

25.根据权利要求24所述的方法,其中所述t核苷酸具有以下结构:

26.根据权利要求24或25所述的方法,其中所述t核苷酸具有以下结构:

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法,其中所述a核苷酸具有以下结构:

28.根据权利要求27所述的方法,其中所述a核苷酸具有以下结构:

29.根据权利要求27或28所述的方法,其中所述a核苷酸具有以下结构:

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法,其中所述c核苷酸具有以下结构:

31.根据权利要求30所述的方法,其中所述c核苷酸具有以下结构:

32.根据权利要求30或31所述的方法,其中所述c核苷酸具有以下结构:

33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法,其中所述g核苷酸具有以下结构:

34.根据权利要求33所述的方法,其中所述g核苷酸具有以下结构:

35.根据权利要求33或34所述的方法,其中所述g核苷酸具有以下结构:

36.根据权利要求1至22中任一项所述的方法,其中至少一种类型的核苷酸具有选自由以下项组成的组的结构:

37.根据权利要求36所述的方法,其中至少一种类型的核苷酸具有选自由以下项组成的组的结构:

38.一种平行确定多个不同的靶多核苷酸的序列的方法,所述方法包括:

39.根据权利要求38所述的方法,其中所述第一类型的未标记的核苷酸的所述第一官能部分经由可裂解接头通过共价结合或非共价相互作用与所述第一标记试剂结合。

40.根据权利要求38或39所述的方法,其中所述水性掺入混合物中的所述四种类型的核苷酸中的每一种类型是未标记的,第二类型的未标记的核苷酸包含第二官能部分,其中所述水性标记混合物包含第二标记试剂,并且所述第二标记试剂包含一个或多个第二可检测标记和能够与所述第二类型的未标记的核苷酸的所述第二官能部分特异性结合的第二结合部分。

41.根据权利要求40所述的方法,其中所述第二类型的未标记的核苷酸的所述第二官能部分经由可裂解接头通过共价结合或非共价相互作用与所述第二标记试剂结合。

42.根据权利要求40或41所述的方法,其中第三类型的未标记的核苷酸包含第三官能部分,其中所述水性标记混合物包含第三标记试剂,并且所述第三标记试剂包含一个或多个第三可检测标记和能够与所述第三类型的未标记的核苷酸的所述第三官能部分特异性结合的第三结合部分。

43.根据权利要求40或41所述的方法,其中第三类型的未标记的核苷酸包含含有所述第一官能部分的所述第三类型的未标记的核苷酸和含有所述第二官能部分的所述第三类型的未标记的核苷酸的混合物,并且其中所述第一标记试剂和所述第二标记试剂均能够与所述第三类型的未标记的核苷酸特异性结合。

44.根据权利要求42或43所述的方法,其中第四类型的未标记的核苷酸不能与所述第一标记试剂、第二标记试剂或第三标记试剂中的任一种标记试剂特异性结合。

45.根据权利要求38至44中任一项所述的方法,其中所述t核苷酸具有以下结构:

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【专利技术属性】
技术研发人员:安托万·弗兰西斯埃琳娜·克蕾西纳凯瑟琳·哈廷安杰莉卡·马里亚尼吴晓琳刘小海
申请(专利权)人:伊路米纳有限公司
类型:发明
国别省市:

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