【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程，特别涉及一种可高效筛选transgene-free编辑植株的重组载体及其应用。
技术介绍
1、基因编辑技术是21世纪生命科学领域的革命性技术，crispr/cas基因编辑技术在作物改良方面具有前所未有的应用潜力，是推动农业产业快速发展的关键技术之一，能够大大缩短选育周期。在国内，已有高油酸大豆、长童期大豆、矮杆玉米等基因编辑安全证书获批，使生物育种商业化成为可能。常规的作物编辑育种一般是将crispr编辑元件及筛选标记构整合到一个质粒上，之后通过农杆菌介导或基因枪转化进入植物细胞，随后转基因元件整合到植物染色体上，可以产生crispr酶和grna实现靶标基因的编辑，部分第一代植株(t0代)在靶位点实现了编辑，绝大多数t0代植株含有crispr转基因元件。t0植株子代，转基因座和编辑基因座都是按照孟德尔遗传规律进行分离。理论上，如果只有1个转基因元件插入到基因组上，那么将有1/4的t1代植株(t0的子代)不含转基因标签。然而，农杆菌或基因枪介导的转基因经常会发生1个以上的转入，因此在t0代植株后代中不含转基因标签的植株比例远低于25％。此外，如果转基因座和编辑基因座是连锁的，那么转基因标签份分离是非常困难的。
2、总之，在后代植株中通过基因型鉴定寻找transgene-free植株，这种方法非常耗时、耗力。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可高效筛选transgene-free编辑植株的重组载体及其应用，利用该重组载体可
2、本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
3、一种可高效筛选transgene-free编辑植株的重组载体，所述重组载体中包含有生殖细胞特异表达barnase基因的表达框，所述表达框包含有生殖细胞特异表达的启动子phas、含有内含子的致死基因barnase和nos终止子，所述重组载体是将表达框整合到烟草的编辑载体中，与基因编辑其他元件形成一个连锁的重组载体，所述表达框的序列如seqid no.1所示。
4、优选地，上述技术方案中，生殖细胞特异表达启动子phas基因是来源于菜豆，用于驱动barnase在生殖细胞特异表达。
5、优选地，上述技术方案中，致死基因barnase的编码序列针对植物偏好性进行了密码子优化，并加入了1个植物来源的内含子，用于该基因在原核生物中的克隆。
6、优选地，上述技术方案中，barnase基因表达框在有性繁殖时，能表达能使雌、雄配子致死的barnase蛋白，使得t0代种子大部分是transgene-free的，其后续子代植株也均为transgene-free。
7、一种利用该重组载体创制无t-dna元件编辑植株的方法，包括以下步骤：
8、(1)生殖细胞特异表达的barnase基因表达框制备
9、barnase基因表达框由phas启动子驱动，nos终止子终止，整个表达框序列如下序列1，由南京金斯瑞公司合成。并利用上下游各含有骨架载体两端15bp同源序列的引物pcr扩增，经琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，获得该表达框线性化dna片段；
10、(2)重组载体的构建：利用限制性内切酶kpni和bsrgi双酶切骨架载体poreu3tr，琼脂糖凝胶电泳切胶回收纯化的线性化骨架dna，将表达框线性化dna与纯化的线性化骨架dna进行重组反应；将重组产物转化进入大肠杆菌，经筛选、测序获得基因编辑重组载体peb140；
11、(3)基因编辑载体的构建：根据靶基因的序列特异性设计出23nt特异序列以及上下游引物，pcr退火连接并转化农杆菌；
12、(4)t0代编辑植株的创制及检测：将基因编辑载体转化烟草叶盘，经愈伤诱导、分化和生根，获得t0代植株；t0代植株取样进行sgrna和靶点突变情况检测，测试其转化效率和编辑效率，收获t0代种子；
13、(5)t1代植株crispr编辑元件和编辑效率检测：t0代种子播种，随机挑选植株进行crispr编辑元件和靶点编辑情况检测，统计分析t1代植株transgene-free植株的比例，以及靶点突变情况检测，分析其遗传稳定性。
14、优选地，步骤(1)中，将barnase基因表达框线性化dna与纯化的线性化骨架dna进行重组反应，反应体系如下：
15、
16、所述重组反应条件：37℃反应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
17、优选地，步骤(2)中，pcr仪退火程序为：95℃5min，-0.1℃/8s，退火至25℃。
18、优选地，步骤(2)中，peb140骨架酶切，酶切体系为：
19、
20、37℃过夜酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收骨架片段；
21、连接体系为：
22、
23、16℃连接2小时，使用胶回收试剂盒纯化连接产物，经电转化转入大肠杆菌中，形成基因敲除载体，摇菌提质粒备用。
24、优选地，所述农杆菌为lba4404，转化后的农杆菌均匀涂布在yeb固体培养基中，过夜培养后获得转化农杆菌。
25、优选地，nos引物序列如下：
26、nos-f：5’-gattgaatcctgttgccggt-3’；
27、nos-r:5’-gtaacatagatgacaccgcg-3’。
28、一种可高效筛选transgene-free编辑植株的重组载体在制备无transgene-free元件编辑植株子代中的应用。
29、优选地，上述技术方案中，barnase基因表达框在有性繁殖时，能表达能使雌、雄配子致死的barnase蛋白，使得t0代种子是transgene-free的，其后续子代植株也均为transgene-free。
30、本专利技术上述技术方案，具有如下有益效果：
31、本专利技术的方案创制基因编辑突变体时，不影响t0代植株的转化效率和编辑效率，t0代编辑植株的子代植株中，transgene-free植株的比例显著高于常规编辑载体，可以很容易得在t1代获得transgene-free编辑植株，有效降低了自交纯合或回交去除t-dna过程所需要的人力、物力和财力。
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1.一种可高效筛选Transgene-free编辑植株的重组载体，其特征在于，所述重组载体中包含有生殖细胞特异表达Barnase基因的表达框，所述表达框包含有生殖细胞特异表达的启动子PHas、含有内含子的致死基因Barnase和NOS终止子，所述重组载体是将表达框整合到烟草的编辑载体中，与基因编辑其他元件形成一个连锁的重组载体，所述表达框的序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的可高效筛选Transgene-free编辑植株的重组载体，其特征在于，所述生殖细胞特异表达的启动子PHas基因来源于菜豆，用于驱动Barnase在生殖细胞特异表达。
3.根据权利要求1所述的可高效筛选Transgene-free编辑植株的重组载体，其特征在于，所述致死基因Barnase的编码序列针对植物偏好性进行了密码子优化，并加入了1个植物来源的内含子，用于该基因在原核生物中的克隆。
4.根据权利要求1所述的可高效筛选Transgene-free编辑植株的重组载体，其特征在于，所述重组载体以pOREU3TR为骨架。
5.一种利用权利要求
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将Barnase基因表达框线性化DNA与纯化的线性化骨架DNA进行重组反应，反应体系如下：
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，酶切体系为：
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述农杆菌为LBA4404，转化后的农杆菌均匀涂布在YEB固体培养基中，过夜培养后获得转化农杆菌。
9.根据权利要求1-4任一所述的可高效筛选Transgene-free编辑植株的重组载体在制备无Transgene-free元件编辑植株子代中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，Barnase基因表达框在有性繁殖时，能表达能使雌、雄配子致死的Barnase蛋白，使得T0代种子是Transgene-free的，其后续子代植株也均为Transgene-free。
...【技术特征摘要】
1.一种可高效筛选transgene-free编辑植株的重组载体，其特征在于，所述重组载体中包含有生殖细胞特异表达barnase基因的表达框，所述表达框包含有生殖细胞特异表达的启动子phas、含有内含子的致死基因barnase和nos终止子，所述重组载体是将表达框整合到烟草的编辑载体中，与基因编辑其他元件形成一个连锁的重组载体，所述表达框的序列如seq id no.1所示。
2.根据权利要求1所述的可高效筛选transgene-free编辑植株的重组载体，其特征在于，所述生殖细胞特异表达的启动子phas基因来源于菜豆，用于驱动barnase在生殖细胞特异表达。
3.根据权利要求1所述的可高效筛选transgene-free编辑植株的重组载体，其特征在于，所述致死基因barnase的编码序列针对植物偏好性进行了密码子优化，并加入了1个植物来源的内含子，用于该基因在原核生物中的克隆。
4.根据权利要求1所述的可高效筛选transgene-free编辑植株的重组载体，其特征在于，所述重组载体以poreu3t...
【专利技术属性】
技术研发人员：张建铎，向海英，王晋，杨光宇，李萌，帅艳菊，邓乐乐，杨文武，许力，蒋佳芮，曾婉俐，高茜，王昆淼，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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