【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞逆分化领域,尤其涉及一种诱导卫星胶质细胞逆分化为神经干细胞样细胞的方法及应用。
技术介绍
1、背根神经节(drg)位于脊髓后角附近,并包含原发传入神经元的细胞体,这些传入神经元将周围区域的疼痛信号传递到中枢神经系统。感觉神经元不能在drg处形成适当的突触,但是神经元的体细胞能够释放神经递质,例如谷氨酸,atp和p物质,并且还表达神经递质和炎性介质的多种受体。在drg,神经元胞体被卫星胶质细胞(sgc)所包绕。这些神经胶质细胞在调节生理性疼痛活动中起积极作用。发生神经性炎症时,sgc则会发生活化形态变化。sgcs不仅对神经元起支持、保护、营养等作用,而且sgcs具有多样性,能表达不同细胞的标记。
2、细胞重编程是指通过改变其表观遗传标记将一种细胞类型转换为另一种细胞类型。这可以通过三种不同的方法来实现:体细胞核转移,细胞融合和转录因子(tf)介导的重编程。tf介导的重编程可以通过多种方式进行,通过直接转分化为新的细胞类型(绕过中间的多能阶段),可以在重新分化为新的细胞类型之前又回到多能状态(也称为诱导多能性),或者通过使用诱导的多能途径而不达到多能状态。转录因子组合筛选常见用于细胞重编程的研究。在神经系统研究中,神经胶质细胞具有高水平的可塑性,并且这些细胞的许多类型存在于神经系统中。神经胶质细胞为神经系统疾病和损伤修复提供了多种治疗靶标。细胞重编程技术为神经再生过程中的细胞转化提供了有效途径,而转录因子介导的重编程可以促进对神经胶质细胞如何成熟为功能性神经元并促进神经功能恢复的理解。研究表明,使用携带
技术实现思路
1、本专利技术提供一种诱导卫星胶质细胞逆分化为神经干细胞样细胞的方法,逆分化效率高,被诱导后的细胞增殖能力强和具有定向分化潜能。
2、为解决上述技术问题,本专利技术的技术方案如下:一种诱导卫星胶质细胞逆分化为神经干细胞样细胞的方法,取坐骨神经损伤后的背根神经节置于原代培养基中进行培养,培养得到背根神经节卫星胶质细胞,将构建好的敲低sox9的表达载体采用慢病毒包装后转染背根神经节卫星胶质细胞,用含有嘌呤霉素的dmem/f12培养基筛选稳定表达的背根神经节卫星胶质细胞;再采用改进的dmem/f12培养基和fbs诱导培养基相继培养背根神经节卫星胶质细胞得到神经干细胞样细胞;
3、构建敲低sox9的shrna表达载体的过程如下:在质粒中插入shrna序列,随后将表达载体转染至细胞中,所述shrna的靶序列如seq id no.1所示,表达载体的序列如seq idno.5所示;表达载体通过慢病毒包装。
4、作为对上述方案的进一步描述:所述敲低sox9的表达载体的构建过程如下:
5、利用ecor i和age i限制性内切酶对质粒和sox9干扰片段进行双酶切,电泳后回收线性质粒;pcr扩增sox9 cds序列,将得到的双链dna经酶切得到shrna oligo片段,将shrna片段与质粒连接得到plv[shrna]-egfp/puro-u6>msox9[shrna];
6、将plv[shrna]-egfp/puro-u6>msox9[shrna]加入到感受态细胞中,轻弹管壁数下混匀,在冰上放置20-40min,41-43℃热激80-100s,冰水浴孵育1.5-2.5min,加入lb培养基,置于37℃摇床振荡培养0.8-1.2h;取菌液均匀涂布在含有0.09-0.11mg/ml的氨苄青霉素的dmem/f12培养基中,在恒温培养箱中倒置培养12-16h;待平板上长出菌落,挑取适量菌落于含90-110mg·l-1氨苄青霉素的lb培养基中,36.8-37.2℃摇床振荡过夜,吸取适量菌液进行pcr和琼脂糖凝胶电泳鉴定;
7、将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含90-110mg·l-1氨苄青霉素的lb液体培养基中,36.8-37.2℃培养12-16h,取适量菌液进行测序,测序成功的阳性菌通过质粒抽提试剂盒提取质粒,然后进行慢病毒包装。
8、作为优选,所述改进的dmem/f12培养基是额外加入1.5-2.5%(v/v)的b27和1.5-2.5%(v/v)的青霉素链霉素溶液的dmem/f12培养基。b27对神经细胞和干细胞具有免疫调节和营养的作用、青霉素链霉素作为双抗能够帮助细胞抗污染,原代细胞转染特别容易造成污染,还有试剂具有毒性,易造成细胞死亡和转染效率低下,所以抗污染和营养细胞必须同时进行。
9、作为优选,所述fbs诱导培养基的成分如下:50ml改进的dmem/f12培养基中加入0.5-5ml的fbs。fbs诱导培养基是dmem/f12培养基中加入不同比例的fbs,fbs具有促进干细胞再分化的能力,通过fbs诱导培养基检测卫星胶质逆分化的神经干细胞样细胞是否有再分化的能力,再次证明卫星胶质确实已逆分化。
10、本专利技术还提供所述诱导卫星胶质细胞逆分化为神经干细胞样细胞的方法得到的神经干细胞样细胞。
11、本专利技术还提供所述的神经干细胞样细胞在制备修复坐骨神经损伤药物中的应用。
12、本专利技术的特点如下:本专利技术提供了一种诱导卫星胶质细胞逆分化为神经干细胞样细胞的方法,通过建立坐骨神经损伤模型后取出卫星胶质细胞,构建胶质生成关键转录因子sox9敲低的稳转原代卫星胶质细胞,白光倒置显微镜和透射电镜观察细胞形态,并通过免疫荧光检测神经干细胞标记物nestin、sox2的表达,流式鉴定其活性状态,用不同体积分数的胎牛血清(fbs)培养诱导后的细胞使其定向分化为胶质细胞和神经元。本专利技术成功使用转录因子sox9将坐骨神经损伤后原代卫星胶质细胞诱导为神经干细胞样细胞,在此过程中本专利技术发现drg-sgcs在损伤后可能会转变为“反应性drg-sgcs”来响应损伤,而敲低sox9与之协同促进损伤反应性drg-sgcs发生逆分化,被诱导后的细胞满足神经干细胞特点:增殖能力强和具有定向分化潜能,为进一步研究周围神经系统再生提供参考价值。
13、本专利技术得到背根神经节神经干细胞样细胞后,通过建立小鼠坐骨神经损伤模型,brdu标记法观察异体同源背根神经节干细胞样细胞进入损伤部位的增殖能力,将最适计数量的异体同源背根神经节干细胞直接注射到坐骨神经损伤处。实验结果表明:所述神经干细胞样本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种诱导卫星胶质细胞逆分化为神经干细胞样细胞的方法,其特征在于,取坐骨神经损伤后的背根神经节置于原代培养基中进行培养,培养得到背根神经节卫星胶质细胞,将构建好的敲低Sox9的表达载体采用慢病毒包装后转染背根神经节卫星胶质细胞,用含有嘌呤霉素的DMEM/F12培养基筛选稳定表达的背根神经节卫星胶质细胞;再采用改进的DMEM/F12培养基和FBS诱导培养基相继培养背根神经节卫星胶质细胞得到神经干细胞样细胞;
2.根据权利要求1所述的诱导卫星胶质细胞逆分化为神经干细胞样细胞的方法,其特征在于,所述敲低Sox9的表达载体的构建过程如下:
3.根据权利要求1所述的诱导卫星胶质细胞逆分化为神经干细胞样细胞的方法,其特征在于,所述改进的DMEM/F12培养基是加入1.5-2.5%(V/V)B27和1.5-2.5%(V/V)青霉素链霉素溶液的DMEM/F12培养基。
4.根据权利要求3所述的诱导卫星胶质细胞逆分化为神经干细胞样细胞的方法,其特征在于,所述FBS诱导培养基的成分如下:50mL改进的DMEM/F12培养基中加入0.5-5mL的FBS。
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1.一种诱导卫星胶质细胞逆分化为神经干细胞样细胞的方法,其特征在于,取坐骨神经损伤后的背根神经节置于原代培养基中进行培养,培养得到背根神经节卫星胶质细胞,将构建好的敲低sox9的表达载体采用慢病毒包装后转染背根神经节卫星胶质细胞,用含有嘌呤霉素的dmem/f12培养基筛选稳定表达的背根神经节卫星胶质细胞;再采用改进的dmem/f12培养基和fbs诱导培养基相继培养背根神经节卫星胶质细胞得到神经干细胞样细胞;
2.根据权利要求1所述的诱导卫星胶质细胞逆分化为神经干细胞样细胞的方法,其特征在于,所述敲低sox9的表达载体的构建过程如下:
3.根据权利要求1所述的诱导卫星...
【专利技术属性】
技术研发人员:刘矿嫔,李力燕,马微,杨金伟,王海雷,王乐,殷露玮,张丝嘉,
申请(专利权)人:昆明医科大学,
类型:发明
国别省市:
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