【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及三萜类化合物的生物合成，具体涉及氧化鲨烯环化酶mtbuts、其编码基因及应用。
技术介绍
1、柠檬苦素类化合物是一类高度氧化的三萜类化合物，主要存在于楝科和芸香科植物中。这些化合物因其独特的结构和化学多样性而闻名，并且表现出广泛的生物活性，例如抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等。此外，它们还具有广泛的抗虫和拒食活性，因此成为绿色农药开发的重要资源。然而，除了印苦楝酮(azadirone)以外，其余的柠檬苦素类化合物的生物合成途径基本上是未知的。根据生源途径的推导，柠檬苦素类化合物是由甘遂烷型(20s)或大戟烷型(20r)的三萜骨架经过修饰形成的。前人在楝科和芸香科物种中均鉴定到了催化甘遂烷型三萜骨架的氧化鲨烯环化酶(oxidosqualene cyclase,osc)基因，例如aiosc1,maosc1,csosc1和mtosc1，其编码的氧化鲨烯环化酶能催化2,3-氧化鲨烯形成替卢卡醇(tirucalla-7,24-dien-3β-ol)(20s)，替卢卡醇经过修饰能进一步形成抗虫化合物印苦楝酮。通过对楝科植物osc基因家族生化功能的研究，将为柠檬苦素类化合物生物合成途径的解析以及最终利用微生物底盘高效合成绿色杀虫剂奠定基础。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种来自川楝的氧化鲨烯环化酶mtbuts、其编码基因及应用。
2、本专利技术提供一种氧化鲨烯环化酶mtbuts，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
3、本专利技术还提供编
4、在一些实施例中，所述基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
5、本专利技术还提供含有所述基因的表达盒、载体或宿主菌。
6、所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子、所述基因以及转录终止子组成。
7、所述载体可以是任何合适的克隆载体，包含上述基因以及质粒复制所需的其它元件。在一些实施例中，所述克隆载体为ptopo-blunt载体。
8、所述载体也可以是任何合适的表达载体，包含上述基因以及能够使蛋白成功表达的其它元件。在一些实施例中，所述表达载体为pdest1。
9、所述宿主菌可以是包含上述克隆载体的宿主菌。在一些实施例中，所述宿主菌为e.coli dh5α，通过在适当的条件下培养宿主菌，使上述基因得到复制。
10、所述宿主菌也可以是包含上述表达载体的宿主菌。在一些实施例中，所述宿主菌为根癌农杆菌eha105，通过根癌农杆菌介导的遗传转化技术将表达载体导入宿主植物中，使上述基因得到表达。在一些实施例中，所述宿主植物为烟草。在一些实施例中，所述烟草为本氏烟草(nicotiana benthamiana)。
11、本专利技术还提供一种克隆所述基因的方法，包括：提取川楝植物组织的rna并反转录为cdna；以cdna为模板进行聚合酶链式反应，克隆得到所述基因。
12、所述川楝植物组织可以是川楝的根、茎、叶、花、果实或种子的组织。在一些实施例中，所述川楝植物组织为川楝的根部或茎部的韧皮组织。
13、在一些实施例中，用于所述聚合酶链式反应的引物的核苷酸序列如seq id no:3和seq id no:4所示。
14、所述氧化鲨烯环化酶mtbuts在氧化鲨烯环化反应中的用途也属于本专利技术的范围。
15、所述氧化鲨烯环化酶mtbuts在丁酰鲸鱼醇合成中的用途也属于本专利技术的范围。
16、本专利技术还提供一种获得丁酰鲸鱼醇的方法，包括：在烟草中同时表达所述氧化鲨烯环化酶mtbuts和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶(3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme areductase,hmgr)；采集成功表达了这两种酶的烟草叶片并提取丁酰鲸鱼醇。
17、上述方法中，可以将mtbuts的基因表达载体和hmgr的基因表达载体同时导入烟草中，使mtbuts和hmgr共表达6-8天，然后采集烟草叶片，冻干后打磨成粉末，并提取丁酰鲸鱼醇。
18、上述方法中，可以通过根癌农杆菌介导的遗传转化技术将mtbuts的基因表达载体和hmgr的基因表达载体导入烟草中。所述根癌农杆菌可以是任何合适的根癌农杆菌菌株，例如eha105。所述烟草可以是任何合适的烟草种类，例如本氏烟草(nicotianabenthamiana)。
19、上述方法中，可以采用任何合适的化合物提取法从烟草叶片中提取丁酰鲸鱼醇，例如溶剂萃取法。
20、在一些实施例中，将成功表达mtbuts和hmgr的烟草叶片冻干后磨成粉末，将烟草粉末与裂解液充分混匀，置于70℃水浴2h，得到样品裂解液。裂解液(100ml)的配方如下：koh，10g；无水乙醇，90ml；ddh2o补齐至100ml。将样品裂解液在室温下离心后吸取上清，用等体积正己烷萃取3次，合并3次萃取液。用等体积的饱和食盐水洗涤得到的萃取液，吸取上层正己烷相，重复本步骤2次。所得正己烷相用氮气吹干或放在通风橱中挥干，得到提取物。加入正己烷重新溶解提取物，并用有机滤膜过滤掉不溶性杂质，得到提取液。
21、在一些实施例中，所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶的核苷酸序列如seq idno:5所示。
22、综上，我们从川楝中克隆得到了一种新的氧化鲨烯环化酶基因mtbuts。利用烟草表达体系对氧化鲨烯环化酶mtbuts的生化功能进行分析。结果表明，mtbuts能够专一性地催化2,3-氧化鲨烯形成丁酰鲸鱼醇(butyrospermol)，一种大戟烷型的三萜骨架结构，是柠檬苦素类化合物生物合成途径的关键酶。本专利技术为柠檬苦素类化合物生物合成途径的解析以及利用合成生物学开发柠檬苦素类绿色生物农药奠定了基础。
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1.一种氧化鲨烯环化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.编码权利要求1所述的氧化鲨烯环化酶的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.含有权利要求2或3所述的基因的表达盒、载体或宿主菌。
5.克隆权利要求2或3所述的基因的方法，包括：提取川楝植物组织的RNA并反转录为cDNA；以cDNA为模板进行聚合酶链式反应，克隆得到所述基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：用于所述聚合酶链式反应的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
7.权利要求1所述的氧化鲨烯环化酶在氧化鲨烯环化反应中的用途。
8.权利要求1所述的氧化鲨烯环化酶在丁酰鲸鱼醇合成中的用途。
9.一种获得丁酰鲸鱼醇的方法，包括：在烟草中同时表达权利要求1所述的氧化鲨烯环化酶和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶；采集成功表达了这两种酶的烟草叶片并提取丁酰鲸鱼醇。
10.根据权利要求9所述的方法，其
...【技术特征摘要】
1.一种氧化鲨烯环化酶，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
2.编码权利要求1所述的氧化鲨烯环化酶的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
4.含有权利要求2或3所述的基因的表达盒、载体或宿主菌。
5.克隆权利要求2或3所述的基因的方法，包括：提取川楝植物组织的rna并反转录为cdna；以cdna为模板进行聚合酶链式反应，克隆得到所述基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：用于所述聚合酶链式反应的引物...
【专利技术属性】
技术研发人员：漆小泉，刘波，张凡，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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