用姜黄素治疗人多发性骨髓瘤制造技术

所有检测的多发性骨髓瘤细胞系均显示组成型活化的Ｉ↓［ｋ］Ｂ激酶（ＩＫＫ）、Ｉ↓［ｋ］Ｂα磷酸化和组成型活化的ＮＦ－［ｋ］↓Ｂ。化学预防剂姜黄素可通过抑制ＩＫＫ活性和下调ＮＦ－［ｋ］↓ｂ而抑制组成型Ｉ↓［ｋ］Ｂα磷酸化。姜黄素也能下调ＮＦ－［ｋ］↓Ｂ－调节基因产物的表达，如Ｉ↓［ｋ］Ｂα、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘ↓［Ｌ］、细胞周期蛋白Ｄ１和白介素－６的表达。结果，姜黄素抑制多发性骨髓瘤细胞增殖和抑制细胞处在细胞周期的Ｇ１／Ｓ期。姜黄素也能诱导细胞凋亡和对长春新碱的化学敏感性。总之，本文所示结果提供了用此药学上安全的制剂治疗多发性骨髓瘤病人的分子基础。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用姜黄素治疗人多发性骨髓瘤的制作方法参照相关专利申请本非临时专利申请要求2002年6月24日提交现已撤销的美国临时专利申请序列号60/390,926的权益。
技术介绍
专利
本专利技术总的涉及癌生物领域。更具体说，本专利技术揭示用姜黄素治疗人多发性骨髓瘤的方法。相关领域的描述多发性骨髓瘤是一种B细胞恶性肿瘤，其特征是增殖指数低且寿命延长的分泌性浆细胞在骨髓中的潜优性积聚。多发性骨髓瘤占所有癌症的1％和所有血液癌的10％以上。其标准治疗方案包括联合应用长春新碱、BCNU、美法仑、环磷酰胺、阿霉素和强的松或地塞米松。尽管采用大剂量糖皮质激素和烷化剂治疗，此恶性瘤仍不能治愈。其完全缓解率是5％，存活时间中值是30-36个月。在90％以上的病人中，此病变为化学药物抗性。因此，治疗多发性骨髓瘤迫切需要安全和有效的制剂。现认为浆细胞的细胞凋亡机制失调是多发性骨髓瘤发病机理和后来的化学药物抗性的主要因素。已确定以自分泌或旁分泌方式产生的IL-6通过调节肿瘤细胞的生长和存活在多发性骨髓瘤恶性发展中起着重要作用。IL-6的存在导致组成型活化Stat 3，进而导致高水平抗细胞凋亡蛋白Bcl-xL的表达。Bcl-2过度表达是大部分多发性骨髓瘤细胞系的另一个重要特征，拯救这些肿瘤细胞避免了糖皮质激素诱导的细胞凋亡。用TNF治疗多发性骨髓瘤细胞使NF-kB活化，诱导IL-6分泌，诱导各种粘附分子表达和促进增殖。此外，多发性骨髓瘤细胞显示可表达能活化NF-kB受体的配基(RANKL)，RANKL是TNF超家族的成员，能介导多发性骨髓瘤诱导的溶骨性疾病。多发性骨髓瘤细胞发展成细胞凋亡抗性的一种可能机制是通过活化核转录因子NF-kB。在正常条件下，NF-kB作为无活性的异三聚体存在于细胞质中，由p50、p65和IkBα亚基组成。活化时，IkBα经过磷酸化和泛素-依赖的26S蛋白体降解，从而使p50-p65异二聚体上暴露出核定位信号，导致核转位和结合于特异的共有DNA序列(5’-GGGACTTTC-3’，SEQ ID NO.1)。NF-kB结合于DNA可活化基因表达，进而导致基因转录。通过活化IkBα激酶(IKK)而发生IkBα磷酸化。IkB激酶复合体由3种蛋白质IKKa、IKKb和IKKg/NF-kB必需调节物(NEMO)组成。IKKα和IKKβ是能磷酸化IkBα的激酶，而IKKγ/NEMO是对IKKα和IKKβ活性关键的支架蛋白质。过去几年中的广泛研究表明NF-kb可调节各种基因的表达，这些基因在细胞凋亡、肿瘤发生和炎症中起着关键作用。一些NF-kB调节基因包括IkBα、细胞周期蛋白D1、Bcl-2、bcl-xL、COX-2、IL-6和粘附分子ICAM-1、VCAM-1和ELAM-1。近来报导NF-kB在多发性骨髓瘤细胞中可被组成型活化，导致bcl-2表达，而此表达可拯救这些细胞避免了糖皮质激素诱导的细胞凋亡。由于多发性骨髓瘤细胞表达IL-6、多种粘附分子、Bcl-xL和Bcl-2，都受到NF-kb的调节，也由于它们的抑制能导致细胞凋亡，已提出NF-kB是治疗多发性骨髓瘤的重要靶标。然而，现有技术不足以鉴定能阻断多发性骨髓瘤中组成型NF-kb活化的药学上安全和有效的制剂。本专利技术满足了本领域这一长期存在的需求。专利技术概述由于核转录因子NF-kB在细胞存活和增殖中的重要作用，研究了将它用作治疗多发性骨髓瘤的靶标的可能性，采用已知在人中体毒性很小或无毒的制剂姜黄素(二阿魏酸基甲烷(diferuloylmethane))。NF-kb能在所有检测的人多发性骨髓瘤细胞系中组成型活化，化学预防剂姜黄素如电泳迁移率变化试验所示那样，能下调所有细胞系中的NF-kB，且如免疫细胞化学所示那样，能防止p65的核内保留。所有多发性骨髓瘤细胞系显示有组成型活化的IkB激酶(IKK)和IkBα磷酸化。姜黄素能通过抑制IkB激酶活性来抑制组成型IkBα磷酸化。姜黄素也能下调NF-kB-调节基因产物的表达，包括IkBα、Bcl-2、Bcl-xL、细胞周期周期蛋白D1和白介素-6的表达。这导致增殖抑制和细胞停滞在细胞周期的G1/S期。IKKg/NF-kB必需调节物-结合结构域肽对NF-kB复合体的抑制，也抑制了多发性骨髓瘤细胞的增生。姜黄素也能诱导细胞凋亡，如通过胱冬酶-7和胱冬酶-9的活化和PARP切割所示。姜黄素诱导的NF-kB下调也诱导了对长春新碱的化学敏感性，其中NF-kB是参与化学抗性的一种因子。这些结果表明姜黄素能下调人多发性骨髓瘤细胞中的NF-kB，从而抑制增殖和诱导细胞凋亡。本专利技术也测试了22个多发性骨髓瘤患者骨髓的CD138+细胞并通过免疫细胞化学核查NF-kB和STAT3的活化形式。发现所有病人的多发性骨髓瘤细胞均表达NF-kB和STAT3的活化形式。NF-kB的组成型活化已独立的通过电泳迁移率变化试验得到验证。与多发性骨髓瘤患者相反，健康个体的细胞中没有NF-kB和STAT3。活体外用姜黄素(二阿魏酸基甲烷)处理抑制多发性骨髓瘤细胞中的NF-kB和STAT3活化，导致了细胞活力减少。地塞米松可部分抑制NF-kB活化且对骨髓瘤细胞的细胞毒性最小。总之，这些结果表明多发性骨髓瘤患者的新鲜细胞能表达组成型活化的NF-kB和STAT3，抑制这些转录因子可抑制这些细胞的存活。本专利技术的其它和更多方面、特征和优点将从以下提供的本专利技术优选实施方案的描述中得知。给出这些实施方案目的是说明。附图的简要说明附图说明图1显示姜黄素抑制多发性骨髓瘤细胞中的组成型核NF-kB。图1ANF-kB对姜黄素处理U266细胞的剂量反应。将200万个细胞/ml用所示浓度的姜黄素处理4小时，并用EMSA测试核NF-kB。图1B接触持续时间对U266细胞中姜黄素诱导的NF-kB抑制的作用。细胞用姜黄素(50μM)处理所示时间并用EMSA测试核NF-kB。图1C接触持续时间对MM.1细胞中姜黄素诱导的NF-kB抑制的作用。细胞如图1B所述处理。图1D接触持续时间对MM.1R细胞中姜黄素诱导的NF-kB抑制的作用。细胞如图1B所述处理。图1E接触持续时间对RPMI 8226中姜黄素诱导的NF-kB抑制的作用。细胞如图1B所述处理。图1FNF-kB结合DNA是特异性的且由p50和p65亚基组成。从U266细胞(2×106/ml)中制备核提取物，用不同抗体或未标记的NF-kB寡核苷酸探针孵育30分钟，然后用EMSA测定NF-kB。图2显示姜黄素诱导p65的重分布。U266和RPMI 8226细胞单独或用姜黄素(50μM)孵育4小时，然后用免疫细胞化学分析p65的分布。红色表示p65的定位，蓝色(Hoechst)表示核(放大200X)，图3显示姜黄素抑制IkBα磷酸化和IkB激酶。将500万个U266细胞/2.5ml用姜黄素(50μM)处理所示时间并制备细胞质提取物。图3A用蛋白质印迹法测定磷酸化IkBα的水平。图3B免疫沉淀IkB激酶和测定IkB激酶活性的激酶试验(上面一排图)或蛋白质印迹法分析细胞质提取物中的总IKKα和IKKβ蛋白质(下面一排图)。图3C免疫沉淀IkB激酶，激酶试验在没有或存在所示浓度姜黄素时进行(上面一排图)。下面一排图表示在同一干燥凝胶的各孔中用考马斯蓝染色的GS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：使所述细胞接触姜黄素，其中所述姜黄素能抑制多发性骨髓瘤细胞增殖。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2002-6-24 60/390,9261.一种抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤使所述细胞接触姜黄素，其中所述姜黄素能抑制多发性骨髓瘤细胞增殖。2.一种诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤使所述细胞接触姜黄素，其中所述姜黄素诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡。3.一种提高化学治疗剂抗多发性骨髓瘤细胞的细胞毒作用的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤使所述细胞接触化学治疗剂和姜黄素，其中所述姜黄素能提高所述化学治疗剂抗多发性骨髓瘤细胞的细胞毒作用。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述化学治疗剂选自长春新碱、BCNU、美法仑、环磷酰胺、阿霉素、强的松和地塞米松。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多发性骨髓瘤细胞是CD138+浆细胞。6.一种治疗个体中多发性骨髓瘤的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：B艾加瓦尔，
申请(专利权)人：研究发展基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]