【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学和分子免疫学，具体涉及到一种鸡p4hb蛋白多克隆抗体的制备方法及其应用。
技术介绍
1、鸡p4hb蛋白，也被称为蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,pdi)，是一种在鸡体内广泛存在的蛋白质。主要存在于细胞内质网(endoplasmicreticulum,er)中,也可以被释放到细胞表面和细胞外基质中。其生物学功能是促进二硫键(sgs)的形成、破裂和重排。而sgs是连接两个半胱氨酸残基的共价键,是维持蛋白质空间结构的重要组成元件,其变化能够影响蛋白质的结构和功能。研究证明p4hb在蛋白质产生、释放过程中起到氧化还原酶、异构酶和分子伴侣的作用。除此之外，p4hb蛋白在蛋白质折叠和功能性修饰中扮演着关键角色。它能帮助蛋白质正确折叠并形成功能性结构，这对于维持细胞内的蛋白质稳态至关重要。p4hb蛋白还参与调节细胞和细胞信号传导过程。这对于维持细胞间通讯和协调细胞行为具有重要意义。
2、自蛋白二硫键异构酶被发现以来，国内外研究者对其结构与生物学功能进行了大量研究,发现其与血栓性疾病、肿瘤和神经退行性疾病有密切联系，提示了其具有作为新治疗靶点的潜力,以及作为疾病诊断和预后生物标志物的潜能。鸡作为我国重要的经济家畜和人们动物蛋白的主要来源，保证鸡的健康，提高鸡的生产性能是畜牧兽医工作的重要责任。同时，鸡作为一种重要的模型动物，开展鸡的研究也为进一步研究人类疾病提供重要的参考价值。但是，由于市场上检测鸡蛋白抗体的缺乏，严重制约了对鸡p4hb蛋白功能的研究。因此，制备用于鸡p
技术实现思路
1、本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本专利技术。
3、因此，本专利技术的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种鸡his-p4hb修饰多肽。
4、为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：所述鸡his-p4hb修饰多肽的氨基酸序列如seq id no.3所示。
5、所述鸡his-p4hb修饰多肽由如seq id no.1所示的鸡p4hb多肽的氨基酸序列筛选肽段进行组氨酸标签修饰后原核表达得来。
6、本专利技术的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种鸡his-p4hb修饰多肽的多克隆抗体,所述鸡his-p4hb修饰多肽的多克隆抗体通过鸡his-p4hb修饰多肽作为抗原免疫获得。
7、本专利技术的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种鸡his-p4hb修饰多肽的多克隆抗体的制备方法。
8、为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：pcr扩增鸡p4hb基因，并将其同源重组至表达载体中，构建原核重组表达质粒pcoldii-p4hb；
9、将重组质粒转化e.coli bl21并用iptg进行诱导表达，然后利用ni-nta亲和层析方法进行蛋白纯化，将纯化的his-p4hb蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后免疫再分离血清，经proteina+g亲和层析纯化后冻存于-80℃得到多克隆抗体。
10、作为本专利技术所述制备方法的一种优选方案，其中：所述免疫条件为采用颈背部多点皮下注射，首免后第3周和第5周分别进行二免和三免，均采用弗氏不完全佐剂乳化，方法和剂量与首免相同。
11、作为本专利技术所述制备方法的一种优选方案，其中：所述免疫剂量为200μg/只。
12、作为本专利技术所述制备方法的一种优选方案，其中：所述三免后第9天，通过耳缘静脉采血分离血清。首免后第7周进行第四次免疫，一周后心脏采血。
13、作为本专利技术所述制备方法的一种优选方案，其中：所述原核重组表达的his-p4hb蛋白表达在e.coli bl21细胞上清中，分子质量约为25kda。
14、本专利技术的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种鸡his-p4hb修饰多肽的多克隆抗体在检测鸡p4hb蛋白表达以及研究p4hb蛋白功能及作用机制中的应用。
15、作为本专利技术所述应用的一种优选方案，其中：所述多克隆抗体通过western blot和间接免疫荧光鉴定鸡原代巨噬细胞表达的内源p4hb蛋白的表达与细胞定位情况。
16、本专利技术有益效果：
17、(1)本专利技术利用pcr方法扩增了鸡p4hb基因，并将其同源重组至pcoldii载体中，构建了原核重组表达质粒pcoldii-p4hb。将重组质粒转化e.coli bl21(de3)并用iptg进行诱导表达，表达的his-p4hb重组蛋白经sds-page方法鉴定，sds-page结果显示约25kda处有一条明显的条带。然后利用ni-nta亲和层析方法进行蛋白纯化，将纯化的his-p4hb蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后，将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔，采用颈背部多点皮下注射，免疫剂量为200μg/只，首免后第3周和第5周分别进行二免和三免，均采用弗氏不完全佐剂乳化，方法和剂量与首免相同。三免后第9天，通过耳缘静脉采血分离血清。首免后第7周进行第四次免疫，一周后心脏采血。该抗体经proteina+g亲和层析纯化后冻存于-80℃冰箱。通过western blot和间接免疫荧光染色技术(if)鉴定鸡原代巨噬细胞(hd11)表达的内源p4hb蛋白的表达与细胞定位情况进而验证其应用。
18、(2)本专利技术原核表达的his-p4hb蛋白表达在e.coli bl21细胞上清中，分子质量约为25kda；实验兔4次免疫p4hb重组蛋白后采血并分离血清，经过纯化，该抗体能够用于westernblot和if鉴定鸡内源p4hb蛋白的表达和细胞定位。
19、(3)本专利技术通过预测抗原决定簇，使用原核表达技术制备了his-p4hb多肽，免疫新西兰大白兔，成功制备其多克隆抗体，该抗体经验证可用于鸡p4hb线性或天然构象蛋白的定性、定量和细胞定位等应用方向，这为进一步探究鸡蛋白质二硫键异构酶的生物学功能，以及该酶产生的催化反应所发挥的生物学功能打下了基础。
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1.一种鸡HIS-P4HB修饰多肽，其特征在于：所述鸡HIS-P4HB修饰多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的鸡HIS-P4HB修饰多肽，其特征在于：所述鸡HIS-P4HB修饰多肽由如SEQ ID NO.1所示的鸡P4HB多肽的氨基酸序列筛选肽段进行组氨酸标签修饰后原核表达得来。
3.一种鸡HIS-P4HB修饰多肽的多克隆抗体，其特征在于：所述鸡HIS-P4HB修饰多肽的多克隆抗体通过鸡HIS-P4HB修饰多肽作为抗原免疫获得。
4.如权利要求3所述的鸡HIS-P4HB修饰多肽的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括：
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述免疫条件为采用颈背部多点皮下注射，首免后第3周和第5周分别进行二免和三免，均采用弗氏不完全佐剂乳化，方法和剂量与首免相同。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述免疫剂量为200μg/只。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述三免后第9天，通过耳缘静脉采血分离血清。首免后第7周进行第四次免疫
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述原核重组表达的HIS-P4HB蛋白表达在E.coli BL21细胞上清中，分子质量约为25KDa。
9.如权利要求3所述的鸡P4HB蛋白修饰多肽的多克隆抗体在检测鸡P4HB蛋白表达以及研究P4HB蛋白功能及作用机制中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述多克隆抗体通过Western blot和间接免疫荧光鉴定鸡原代巨噬细胞表达的内源P4HB蛋白的表达与细胞定位情况。
...【技术特征摘要】
1.一种鸡his-p4hb修饰多肽，其特征在于：所述鸡his-p4hb修饰多肽的氨基酸序列如seq id no.3所示。
2.如权利要求1所述的鸡his-p4hb修饰多肽，其特征在于：所述鸡his-p4hb修饰多肽由如seq id no.1所示的鸡p4hb多肽的氨基酸序列筛选肽段进行组氨酸标签修饰后原核表达得来。
3.一种鸡his-p4hb修饰多肽的多克隆抗体，其特征在于：所述鸡his-p4hb修饰多肽的多克隆抗体通过鸡his-p4hb修饰多肽作为抗原免疫获得。
4.如权利要求3所述的鸡his-p4hb修饰多肽的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括：
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述免疫条件为采用颈背部多点皮下注射，首免后第3周和第5周分别进行二免和三免，均采用弗氏不...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋瑞龙，芮舒颜，彭韵雯，张宛，羊扬，何丽霞，蒋宁，仝锡帅，邹辉，马勇刚，刘宗平，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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