【技术实现步骤摘要】
技术介绍
1、实时rt-pcr是一种用于经由随时间检测随着扩增子在qpcr反应中的产生而增加的荧光信号检测样品中rna的方法。目前，rt-pcr最广为人知的应用是在诊断实验室测定期间检测患者样品中的病毒遗传物质，诸如sars-cov2(covid-19)的存在。rt-pcr是分子生物学、医学和法医研究的rna靶标检测标准。
2、taq dna聚合酶在分子生物学中常用于在聚合酶链反应(pcr)中延伸核酸扩增子。在pcr中，通过以下三个步骤的重复循环扩增指定的dna区段(扩增子)：变性、退火和扩增子的伸长/延伸。在定性实时pcr(qpcr)的情况下，通过染料或探针产生的荧光信号允许在pcr循环期间收集数据，以便可以测量和记录靶标扩增。基于探针的化学利用经荧光标记的靶标特异性探针，所述靶标特异性探针仅在与靶标序列结合时释放报告染料，从而允许随着荧光信号强度的增加实时检测靶标扩增。
3、rt-pcr允许检测和扩增rna底物。当在qpcr反应中包含逆转录酶时，可以经由另外的初始循环步骤实现rna的检测，其中逆转录酶产生针对rna底物的互补dna(cdna)；然后可以扩增cdna，以通过伴随的dna聚合酶进行定量。目前的rt-pcr方案依赖于逆转录酶和聚合酶的组合来产生数据。在大多数情况下，taq聚合酶限于dna亚态的扩增；它能够从rna底物产生cdna的少数实例典型地依赖于非常特定的缓冲液和方案1,2，或依赖于氨基酸位置732处天冬氨酸的突变。总体而言，这些情况下的taq活性典型地不如逆转录酶的taq活性稳健。为
技术实现思路
1、本专利技术涉及与野生型聚合酶相比表现出更大的逆转录酶活性的工程化taq dna聚合酶突变体。在附图描述和详细描述中列出的taq dna聚合酶突变体被鉴定为具有这种增强的逆转录酶活性，其中每一种具有添加在c末端处的标签序列：gsgssghhhhhh(seq idno:315)，并且每一种具有在所指示位置处的取代(并且其中每种突变体的dna序列在其后面是奇数序列标识符，并且每种突变体的氨基酸序列在其后面是偶数标识符)。本专利技术进一步包括具有以上突变中的至少一种的taq dna聚合酶氨基酸序列，但其中taq dna聚合酶突变体氨基酸序列的其余部分仅具有保守取代，使得所述分子与序列表中相应的taq dna聚合酶突变体氨基酸序列(下文称为“变体序列”)具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
2、本专利技术还包括在以上突变体的每个氨基酸序列之前的dna序列(即，分别为seq idno:)，并且还包括前述dna序列和其他简并核酸序列(统称为“简并核酸序列”)，其编码(i)以上taq dna聚合酶突变体中的每一种，和(ii)变体序列中的任一种的氨基酸序列。
3、本专利技术进一步包括并入任何简并核酸序列的载体；以及用任何此类载体或简并核酸序列转化并能够表达以上taq dna聚合酶突变体氨基酸序列或变体序列中的任一种的细胞。
4、本专利技术还包括一种组合物或试剂盒，其包含以上taq dna聚合酶突变体氨基酸序列或变体序列、简并核酸序列或并入此类简并核酸序列的载体中的任一种。本专利技术还包括一种扩增靶核酸的方法，其中在被设计来扩增靶核酸的反应混合物中采用以上taq dna聚合酶突变体或变体序列中的任一种，并且使所述试剂混合物经受用于扩增所述靶核酸的条件。
5、与仅在非常严格的反应条件下显示有限的逆转录酶活性的野生型taq dna聚合酶不同，工程化变体可以从rna靶底物中呈现出稳健的cdna，并在标准反应条件下扩增该cdna，而无需添加的逆转录酶的帮助。在qpcr方案中去除对额外逆转录酶的要求可以显著提高经由rt-qpcr检测靶核糖核酸的效率，同时还降低方案复杂性从而允许增加方案优化，并且将缓冲液组成统一为对单一酶最高效的缓冲液组成。
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1.一种突变体Taq聚合酶，所述突变体Taq聚合酶包含在以下奇数序列中示出的以下氨基酸突变中的一个或多个，并且其中所述突变体聚合酶的其余部分与野生型Taq聚合酶具有至少80％氨基酸序列同一性，所述野生型Taq聚合酶如SEQ ID NO:2中所示，但其中野生型Taq聚合酶不包含在其C末端处的6元组氨酸标签和紧接在前的六元甘氨酸和丝氨酸氨基酸：L15S(SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6)、D18R(SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8)、F66A(SEQ IDNO:17；SEQ ID NO:18)、R85D(SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24)、L108S(SEQ ID NO:39；SEQ IDNO:40)、I138S(SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50)、V155S(SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:52)、L156S(SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:54)、K202E(SEQ ID NO:73；SEQ ID NO:74)、K247E(SEQID NO:95；SEQ ID NO:96)、E507G(S
2.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶与所述野生型具有至少90％序列同一性。
3.一种DNA序列，其编码根据权利要求1所述的突变体Taq聚合酶。
4.一种载体，其并入根据权利要求3所述的DNA序列中的一种或多种。
5.一种细胞，其用根据权利要求3所述的DNA序列中的一种或多种转化并进行表达。
6.根据权利要求1所述的突变体Taq DNA聚合酶，其中所述突变体Taq聚合酶能够将mRNA逆转录以产生cDNA。
7.根据权利要求6所述的突变体Taq DNA聚合酶，其中所述将mRNA逆转录以产生cDNA通过38个或更多个扩增循环发生。
8.根据权利要求6所述的突变体Taq DNA聚合酶，其中在相同条件下与通过野生型TaqDNA聚合酶相比，所述将mRNA逆转录以产生cDNA在显著更大的程度上发生。
9.一种逆转录PCR方法，其包括：
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述cDNA的量的检测是通过确定通过嵌入染料或通过标记靶探针的裂解产生的报告物信号的量。
11.一种逆转录qPCR方法，其包括：
12.根据权利要求11所述的qPCR方法，其中存在38个或更多个循环。
13.根据权利要求11所述的qPCR方法，其中所述报告物信号是荧光的。
14.根据权利要求11所述的qPCR方法，其中所述嵌入染料是SYBR绿或Eva绿。
...【技术特征摘要】
1.一种突变体taq聚合酶，所述突变体taq聚合酶包含在以下奇数序列中示出的以下氨基酸突变中的一个或多个，并且其中所述突变体聚合酶的其余部分与野生型taq聚合酶具有至少80％氨基酸序列同一性，所述野生型taq聚合酶如seq id no:2中所示，但其中野生型taq聚合酶不包含在其c末端处的6元组氨酸标签和紧接在前的六元甘氨酸和丝氨酸氨基酸：l15s(seq id no:5；seq id no:6)、d18r(seq id no:7；seq id no:8)、f66a(seq idno:17；seq id no:18)、r85d(seq id no:23；seq id no:24)、l108s(seq id no:39；seq idno:40)、i138s(seq id no:49；seq id no:50)、v155s(seq id no:51；seq id no:52)、l156s(seq id no:53；seq id no:54)、k202e(seq id no:73；seq id no:74)、k247e(seqid no:95；seq id no:96)、e507g(seq id no:119；seq id no:120)、e507l(seq id no:123；seq id no:124)、t544i(seq id no:127；seq id no:128)、d578f(seq id no:131；seqid no:132)、d732s(seq id no:151；seq id no:152)、e742a(seq id no:153；seq id no:154)、e742g(seq id no:155；seq id no:156)、e742m(seq id no...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙大鹏，
申请(专利权)人：武汉爱博泰克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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