【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用单链dna高效构建质粒的方法，属于分子生物学领域。
技术介绍
1、目前构建敲除质粒常使用的效率较高的方法是通过合成或者pcr扩增的方法获取双链dna，然后利用gibson assembly技术或者golden gate等技术将双链dna与目标载体骨架缝合成完整的质粒。直接合成双链dna的成本较高，pcr扩增需要设计引物，进行pcr扩增、电泳、回收等操作，pcr过程增加了突变的可能性，成本高且费时费力。另一方面，近年来，人们试图通过多学科交叉开发可自动化高通量完成合成生物学中设计、构建、测试、学习(dbtl)的各个环节的技术与设备，并将其搭建成大型的“生物代工厂”(bio-foundry)，实现实验室自动化以及更高水平的重现性，已成为合成生物学发展的长期目标之一。因此开发可以高效、低成本构建质粒的方法，可以很好的适配自动化平台，为科研人员在提高工作效率的基础上节省大量的时间和经济成本。现有利用单链dna构建质粒的方法的效率比较低，只能得到有限的转化子并且阳性克隆数目占总克隆数目的比例较低。尽管有使用单链dna构建质粒的试剂盒(neb)报道，但是实际使用效率很低，价格昂贵，无法满足科研人员的科研需求，更加无法满足工业化制备质粒的需求。
技术实现思路
1、【技术问题】
2、现有技术存在的问题主要是构建质粒需要使用双链dna，步骤复杂、容易出错，导致实验所需的实验较长，且双链dna的时间和经济成本较高；利用单链dna构建质粒的效率较低，无法达到与使用双链d
3、【技术方案】
4、针对这些问题，本专利技术开发了一套利用单链dna构建质粒的方法，具有操作简单，效率高，节时经济等优势。
5、本专利技术的第一个目的是提供一种基于单链dna构建质粒的方法，所述方法为：
6、s001将单链dna片段与线性化载体骨架经过同源重组，收集反应液；
7、s002将反应液转化至表达重组酶的大肠杆菌制备得到质粒；
8、所述单链dna片段含有插入片段和重叠区。
9、在一种实施方式中，在插入片段的两端设置有与线性化载体骨架末端相同或互补的重叠区。
10、在一种实施方式中，当插入片段大于100nt时，将插入片段分割成小于30nt的子片段，子片段的两端设置有上下游子片段的重叠区。
11、在一种实施方式中，所述重叠区长度为10～30nt。
12、在一种实施方式中，所述同源重组为吉布森组装。
13、在一种实施方式中，所述吉布森组装的反应体系为gibson assembly母液、单链dna和线性化载体片段。
14、在一种实施方式中，所述单链dna的添加量为1～2pmol，线性化载体片段的添加量为5～7ng。
15、在一种实施方式中，当重叠区长度小于15nt时，所述gibson assembly母液中含有单链dna结合蛋白。
16、在一种实施方式中，所述单链dna结合蛋白的终浓度为4～5μg/ml。
17、在一种实施方式中，所述单链dna结合蛋白包括单链dna结合蛋白etssb。
18、在一种实施方式中，所述吉布森组装的反应条件为45～55℃反应80～100min。
19、在一种实施方式中，所述重组酶为red/et重组酶。
20、在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌e.coli gb08-red。
21、在一种实施方式中，所述方法还包括将步骤s002中的转化后的大肠杆菌涂布于含有筛选压力的培养基中。
22、在一种实施方式中，所述筛选压力选自线性化载体骨架上的抗性基因。
23、在一种实施方式中，所述线性化载体骨架包括慢病毒载体、腺病毒载体、crispr/cas相关载体、原核表达载体、真核表达载体。
24、在一种实施方式中，所述真核表达载体包括酵母表达载体、昆虫表达载体、哺乳动物细胞表达载体或植物表达载体。
25、本专利技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有吉布森组装反应体系以及表达重组酶的大肠杆菌。
26、在一种实施方式中，所述重组酶为red/et重组酶。
27、在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌e.coli gb08-red。
28、在一种实施方式中，所述试剂盒中还含有单链dna结合蛋白。
29、在一种实施方式中，所述单链dna结合蛋白包括单链dna结合蛋白etssb。
30、本专利技术还提供了上述方法或上述试剂盒在高效、低成本制备质粒中的应用。
31、有益效果：
32、本专利技术开发的一种利用单链dna高效构建质粒的方法，其原理可见图1，含有同源区(overlap)的单链dna和线性化的载体骨架片段在体外酶反应体系和体内酶反应体系的作用下，修复成完整的质粒。本专利技术的方法的第一步为设计含有一条或多条overlap的单链dna，一定范围内overlap越长，进行构建的效率往往越高，正确率也越高，但当overlap的长度大于30nt时，质粒的构建效率显著降低；通过gibosn assembly体外反应，单链dna与线性化的载体骨架完成一定程度的缝合，也可以根据overlap的长度选择性的在反应体系中加入单链dna结合蛋白，可以有效提高使用较短overlap进行质粒构建的准确率；进一步将收集的gibosn assembly体外反应液，转化至表达重组酶的大肠杆菌中，在细胞内重组酶的作用下进一步修复，形成完整的质粒，进行稳定复制。
33、本专利技术的方法可以根据插入片段的长度设计单链dna，当插入片段小于100nt时，在插入片段的两端连接与线性化载体相同或互补的同源区，得到单链dna；当插入片段大于100nt时，将插入片段分割得到多个子片段，子片段的两端与上下游子片段存在相同或互补的同源区，实现针对不同长度的插入片段都可以应用本专利技术的方法进行质粒构建。
34、本专利技术结合体外酶反应体系和体内酶反应体系的作用下，实现了基于单链dna质粒的高效制备，无需pcr扩增、电泳、回收，且构建克隆的效率非常高，可用于1μl以下的体外反应体系，通过随意挑取24个克隆进行质粒提取测序确认正确的效率可达到100％。且由于该方法效率高，反应体系可以很小，因此整个流程可以利用自动化设备进行操作，有效降低科研人员的工作效率，节约时间、经济成本。
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1.一种基于单链DNA构建质粒的方法，其特征在于，所述方法为：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，插入片段的两端设置有与线性化载体骨架末端相同或互补的重叠区。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当插入片段大于100nt时，将插入片段分割成小于30nt的子片段，子片段的两端设置有上下游子片段的重叠区。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述同源重组为吉布森组装。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述吉布森组装的反应体系为Gibsonassembly母液、单链DNA和线性化载体片段。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Gibson assembly母液中含有单链DNA结合蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述单链DNA结合蛋白包括单链DNA结合蛋白ETSSB。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组酶为Red/ET重组酶。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌E.coli GB08-re
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将步骤S002中的转化后的大肠杆菌涂布于含有筛选压力的培养基中。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述线性化载体骨架包括慢病毒载体、腺病毒载体、CRISPR/Cas相关载体、原核表达载体、真核表达载体。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述真核表达载体包括酵母表达载体、昆虫表达载体、哺乳动物细胞表达载体或植物表达载体。
13.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有吉布森组装反应体系以及表达重组酶的大肠杆菌。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述重组酶为Red/ET重组酶。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌E.coliGB08-red。
16.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有单链DNA结合蛋白。
17.权利要求1～12任一所述方法或权利要求13～16任一所述试剂盒在高效、低成本制备质粒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于单链dna构建质粒的方法，其特征在于，所述方法为：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，插入片段的两端设置有与线性化载体骨架末端相同或互补的重叠区。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当插入片段大于100nt时，将插入片段分割成小于30nt的子片段，子片段的两端设置有上下游子片段的重叠区。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述同源重组为吉布森组装。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述吉布森组装的反应体系为gibsonassembly母液、单链dna和线性化载体片段。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述gibson assembly母液中含有单链dna结合蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述单链dna结合蛋白包括单链dna结合蛋白etssb。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组酶为red/et重组酶。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌e.coli gb...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨统见，罗小舟，杰·基斯林，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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