【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及适合于基因工程、细胞工程和细胞药物的细胞及其制造方法。
技术介绍
1、自从crispr/cas系统作为新的基因组编辑工具被报道以来，已经利用crispr/cas系统进行了各种研究(例如专利文献1)。在利用crispr/cas系统的基因组编辑中，cas9核酸酶将被指导rna靶标化的靶区域双链切割。已知双链切割后的dna可通过同源重组修复(homologous directed repair：hdr)或非同源末端连接修复(non-homologous end-joining repair：nhej)而进行修复。hdr中，通过将具有与靶区域的周边区域同源的序列的供体dna与crispr/cas系统一起导入细胞中，能够将任意序列整合到靶区域中。
2、使用基因组改造技术利用hdr同时且高效地改造2个以上等位基因的技术已被开发(例如专利文献2)。专利文献2中公开了能够在2个以上等位基因中同时且高效地诱发数百kb的大规模缺失的技术。
3、为了应对由主要组织相容性基因复合体的差异导致的受体对移植细胞的排斥反应的问题，开发了制造mhc i类的表达和功能缺失的细胞的技术(例如专利文献3)。专利文献3中提出了为了使mhc i类的表达和功能缺失而将β2微球蛋白(b2m)敲除的方案。
4、现有技术文献
5、专利文献
6、专利文献1：国际公开第2014/093661号
7、专利文献2：国际公开第2021/206054号
8、专利文献3：国际公开第2012/14
技术实现思路
1、mhc缺损细胞作为应对免疫排斥问题的有效手段正在被开发，其方法大致分为以下2种：通过破坏mhc以外的分子而使mhc的细胞表面表达丧失的方法、以及破坏mhc的任一分子的方法。但是，mhc基因座的重复序列极多，通过目前的序列解码技术来解码基因座是非常困难的。即使能够进行特定部分的改造，也难以分析出重复序列的其它部分是被维持还是也被改造。因此，就使mhc基因座的特定基因靶标化的技术而言，不能排除基因组中发生了无法预测的改造的可能性，难以利用到用于再生医疗等的细胞的制作中。与此相对，就通过破坏mhc以外的分子而使mhc的细胞表面表达丧失的方法而言，该被破坏的分子的作用(例如β2微球蛋白)不明，目前无法排除由于破坏而产生无法预测的问题的风险。
2、因此，本专利技术提供使mhc的含有特定区域的序列解码困难的重复序列的大的区域缺失、或者将其置换为可解码区域的同时使mhc的特定基因缺失的细胞。本专利技术还提供使用能够高效地改造2个以上等位基因并且能够改造较大区域的基因组改造方法制造该细胞的方法。所得到的细胞适合于移植用途，或者还适合于在细胞工程中的应用。
3、作为一例，本专利技术包括以下方式。
4、[1a]一种细胞(特别是人细胞)，其含有具有缺失的基因组dna(特别是人基因组dna)，上述缺失为包含分别位于1个以上(优选为全部)染色体区域中的hla相似序列聚集区域的一部分或整体的区域(优选为包含整体的区域的缺失)的缺失，上述1个以上(优选为全部)染色体区域选自由以下(i)～(iv)中规定的染色体区域组成的组：
5、(i)含有hla-f、hla-g和hla-a的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：29723464-29945455、优选chr6：29723464-30010618、例如chr6：29722775-29945870或chr6：29711000-30020000的染色体区域对应的染色体区域)；
6、(ii)含有hla-c和hla-b的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：31269169-31357158、优选hg38基因组序列的chr6：31269169-31463338、例如chr6：31268749-31357179或chr6：31176000-31534000对应的染色体区域)；
7、(iii)含有hla-dra、hla-drb5和hla-drb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：32445000-32816951、优选chr6：32439951-32817002的染色体区域对应的染色体区域)；以及
8、(iv)含有hla-doa、hla-dpa1和hla-dpb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：33006838-33086238、优选chr6：33006838-33131199、例如chr6：32934636-33089696或chr6：33002000-33147000的染色体区域对应的染色体区域)，
9、上述hla相似序列聚集区域含有分别包含于上述染色体区域中的hla编码基因和hla相似序列的全部，
10、上述一部分含有至少一个连续(一つながり)的区域，上述一个连续的区域含有选自由分别包含于上述区域的hla编码基因和hla相似序列组成的组中的基因的50％以上。
11、[2a]根据上述[1a]所述的细胞，其中，上述基因组dna中，权利要求1中规定的具有缺失的(i)～(iv)中的任意一者或优选全部不含有或者仅含有1个内源性的hla和hla相似序列。
12、[3a]根据上述[1a]或[2a]所述的细胞，其中，上述基因组dna中，权利要求1中规定的具有缺失的(i)～(iv)中的任意一者或优选全部不含有内源性的hla和hla相似序列。
13、[4a]根据上述[1a]～[3a]中任一项所述的细胞，其具有(i)含有hla-f、hla-g和hla-a的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：29723464-29945455、优选chr6：29723464-30010618、例如chr6：29722775-29945870或chr6：29711000-30020000对应的染色体区域)中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
14、[5a]根据上述[1a]～[4a]中任一项所述的细胞，其具有(ii)含有hla-c和hla-b的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：31269169-31357158、优选hg38基因组序列的chr6：31269169-31463338、例如chr6：31268749-31357179或chr6：31176000-31534000对应的染色体区域)含有hla-c和hla-b的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：31269169-31357158、优选hg38基因组序列的chr6：31269169-31463338、例如chr6：31268749-31357179或chr6：31176000-31534000对应的染色体区域)中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
15、[6a]根据上述[1a]～[5a]中任一项所述的细胞，其具有(iii)含有hla-dr本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细胞，其含有具有缺失的基因组DNA，所述缺失为包含分别位于1个以上染色体区域中的HLA相似序列聚集区域的一部分或整体的区域的缺失，所述1个以上染色体区域选自由以下(i)～(iv)中规定的染色体区域组成的组：
2.根据权利要求1所述的细胞，其中，所述基因组DNA中，权利要求1中规定的具有缺失的(i)～(iv)中的任意一者或优选全部不含有或者仅含有1个内源性的HLA和HLA相似序列。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中，所述基因组DNA中，权利要求1中规定的具有缺失的(i)～(iv)中的任意一者或优选全部不含有内源性的HLA和HLA相似序列。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞，其具有(i)含有HLA-F、HLA-G和HLA-A的一连串区域中的HLA相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组DNA。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞，其具有(ii)含有HLA-C和HLA-B的一连串区域中的HLA相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组DNA。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞，其具有(iii)含有
7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞，其具有(iv)含有HLA-DOA、HLA-DPA1和HLA-DPB1的一连串区域中的HLA相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组DNA。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的细胞，其中，所述缺失为与hg38基因组序列的chr6：29701000～29723464对应的染色体区域中的特有序列(第2序列)中具有另一端的区域的缺失。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的细胞，其中，所述基因组DNA包含以可操作方式连接于控制序列的内源性或外源性的期望基因的插入，该插入位于所述(i)～(iv)中的任一区域内或者所述(i)～(iv)的区域以外的区域。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的细胞，其中，所述缺失为与hg38基因组序列的chr6：31166000～31269169对应的染色体区域中的特有序列(第3序列)中具有一端、并且与hg38基因组序列的chr6：31357158～31544000对应的染色体区域中的特有序列(第4序列)中具有另一端的区域的缺失。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的细胞，其中，所述缺失为与hg38基因组序列的chr6：32416000～33445000对应的染色体区域中的特有序列(第5序列)中具有一端、并且与hg38基因组序列的chr6：32439951-32831000对应的染色体区域中的特有序列(第6序列)中具有另一端的区域的缺失。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的细胞，其中，所述缺失为与hg38基因组序列的chr6：32924000～33006838对应的染色体区域中的特有序列(第7序列)中具有一端、并且与hg38基因组序列的chr6：33086238-33165000对应的染色体区域中的特有序列(第8序列)中具有另一端的区域的缺失。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的细胞，其中，具有缺失的所述(i)～(iv)在其染色体区域内不具有重复序列。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的细胞，其具有功能性β2微球蛋白和功能性CIITA中的任意一者或两者。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的细胞，其中，细胞表面实质上不表达HLAI类和/或HLAII类。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的细胞，其中，缺失为100kb至400kb的大小。
17.一种组合物，其含有权利要求1～16中任一项所述的细胞。
18.一种细胞，其含有具有缺失的基因组，所述缺失为基因组的全部等位基因中的区域的缺失，并且所述缺失包含编码MHC分子的基因座的含有MHC相似序列聚集区域的一部分或优选全部的区域。
19.根据权利要求18所述的细胞，其中，各MHC相似序列聚集区域中仅含有1个以下的编码MHC分子的基因。
20.根据权利要求18所述的细胞，其中，各MHC相似序列聚集区域中仅含有4个以下的编码MHC分子的基因。
21.根据权利要求18所述的细胞，其中，各MHC相似序列聚集区域中不含编码MHC分子的基因。
22.根据权利要求18所述的细胞，其中，缺失为包含编码MHC分子的基因座的含有全部MHC相似序列聚集区域的区域的缺...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种细胞，其含有具有缺失的基因组dna，所述缺失为包含分别位于1个以上染色体区域中的hla相似序列聚集区域的一部分或整体的区域的缺失，所述1个以上染色体区域选自由以下(i)～(iv)中规定的染色体区域组成的组：
2.根据权利要求1所述的细胞，其中，所述基因组dna中，权利要求1中规定的具有缺失的(i)～(iv)中的任意一者或优选全部不含有或者仅含有1个内源性的hla和hla相似序列。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中，所述基因组dna中，权利要求1中规定的具有缺失的(i)～(iv)中的任意一者或优选全部不含有内源性的hla和hla相似序列。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞，其具有(i)含有hla-f、hla-g和hla-a的一连串区域中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞，其具有(ii)含有hla-c和hla-b的一连串区域中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞，其具有(iii)含有hla-dra、hla-drb5和hla-drb1的一连串区域或者与chr6：32445000-32821000对应的染色体区域中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞，其具有(iv)含有hla-doa、hla-dpa1和hla-dpb1的一连串区域中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的细胞，其中，所述缺失为与hg38基因组序列的chr6：29701000～29723464对应的染色体区域中的特有序列(第2序列)中具有另一端的区域的缺失。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的细胞，其中，所述基因组dna包含以可操作方式连接于控制序列的内源性或外源性的期望基因的插入，该插入位于所述(i)～(iv)中的任一区域内或者所述(i)～(iv)的区域以外的区域。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的细胞，其中，所述缺失为与hg38基因组序列的chr6：31166000～31269169对应的染色体区域中的特有序列(第3序列)中具有一端、并且与hg38基因组序列的chr6：31357158～31544000对应的染色体区域中的特有序列(第4序列)中具有另一端的区域的缺失。
11.根据权利要求1～10中任一项所...
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