【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种携带钙离子报告基因的神经元及其制备方法和应用。
技术介绍
1、阿尔茨海默病(ad)是一种神经退行性疾病，主要影响老年人，其特征是标志性神经元病理学，包括β-淀粉样蛋白(aβ)斑块沉积、神经元纤维缠结和神经元死亡，目前已成为神经疾病领域的主要研究对象。已知ad发展过程中会伴随着神经元功能紊乱和结构损伤，而目前缺乏一种对神经元培养环境影响小的钙离子成像工具，以至于用于钙成像实验之后的神经元难以继续监测结构变化。
2、钙成像技术是利用钙指示剂监测组织内钙离子浓度变化的方法。目前常用钙指示剂有钙指示剂染料和荧光报告基因。前者与钙离子结合后，荧光强度显著增强，从而可以指示细胞内钙离子浓度水平的变化。而后者整合到细胞的基因中后发挥指示作用，以gcamp为例，它由增强型绿色荧光蛋白(egfp)和钙调蛋白、钙调蛋白结合肽m13组成，钙调蛋白结合钙离子后，钙调蛋白和m13相互作用引起egfp空间结构变化，发出绿色荧光。
3、目前常见的神经元钙成像方法是对小鼠原代神经元等原代培养的神经元使用fura-2、indo-1等钙指示剂染料进行孵育，此过程中通常还会使用f-127增加染料进入细胞的通透性。染料孵育完成后需要使用缓冲液反复清洗细胞以降低胞外的染料浓度，最后添加任氏液模拟胞外离子环境。但目前钙成像方法需要在实验前对神经元进行一系列处理，包括染料孵育、缓冲液清洗以及任氏液的添加，该过程较为繁琐，且有可能对神经元的结构和功能造成影响，在钙成像实验完成后，神经元的培养环境变化较大，且有染料分子进入胞内
4、综上所述，如何设计钙离子成像方法，实现在同一株细胞上研究功能紊乱和结构变化，是神经元研究领域亟需解决的问题之一。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，为了建立一种对神经元影响较小的钙成像方法，以实现在同一株细胞上研究功能紊乱和结构变化，本专利技术提供一种携带钙离子报告基因的神经元及其制备方法和应用。
2、为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种携带钙离子报告基因的工程化细胞，所述工程化诱导多能干细胞为含有质粒的诱导多能干细胞；所述质粒包括ptet-o-ngn2-puro质粒、fudeltagw-rtta质粒和携带jgcamp7s基因的质粒。
4、本专利技术中，将ptet-o-ngn2-puro质粒、fudeltagw-rtta质粒和携带jgcamp7s基因的质粒导入诱导多能干细胞，可进一步诱导分化为携带钙离子报告基因的神经元，能够实现大批量制备标准化的钙成像神经元，解决目前神经元钙成像实验操作繁琐、对细胞培养环境影响较大等问题。
5、优选地，所述诱导多能干细胞包括人源诱导多能干细胞。
6、本专利技术中，所述携带jgcamp7s基因的质粒可以为本领域通用的含有jgcamp7s报告基因的质粒。
7、优选地，所述携带jgcamp7s基因的质粒包括jgcamp7s和/或pgp-cmv-jgcamp7s。
8、第二方面，本专利技术提供一种携带钙离子报告基因的神经元，所述携带钙离子报告基因的神经元来源于第一方面所述的携带钙离子报告基因的工程化细胞，所述携带钙离子报告基因的神经元细胞为将第一方面所述的携带钙离子报告基因的工程化细胞进行抗生素诱导和筛选后分化培养得到。
9、第三方面，本专利技术提供一种制备第一方面所述的携带钙离子报告基因的工程化细胞的方法，所述方法包括：
10、向诱导多能干细胞中导入ptet-o-ngn2-puro质粒、fudeltagw-rtta质粒和携带jgcamp7s基因的质粒，得到所述的携带钙离子报告基因的工程化细胞。
11、第四方面，本专利技术提供一种第二方面所述的携带钙离子报告基因的神经元的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
12、取第一方面所述的携带钙离子报告基因的工程化细胞在含有抗生素的培养基中进行培养，得到所述携带钙离子报告基因的神经元。
13、优选地，所述抗生素包括多西霉素和嘌呤霉素。
14、优选地，所述多西霉素的工作浓度为1～3μg/ml，包括但不限于1.2μg/ml、1.4μg/ml、1.6μg/ml、1.8μg/ml、2μg/ml、2.2μg/ml、2.5μg/ml、2.6μg/ml、2.8μg/ml或2.9μg/ml，嘌呤霉素的工作浓度为0.3～0.7μg/ml，包括但不限于0.4μg/ml、0.5μg/ml或0.6μg/ml。
15、第五方面，本专利技术提供第一方面所述的携带钙离子报告基因的神经元的在神经元钙成像中的应用。
16、第六方面，本专利技术提供一种神经元钙成像的方法，所述方法包括：
17、培养第二方面所述的携带钙离子报告基因的神经元，使用共聚焦显微镜对神经元进行序列拍照，拍照过程中在培养液中加入氯化钾。
18、优选地，所述氯化钾为氯化钾溶液，所述氯化钾溶液的工作浓度为600～700mm，包括但不限于610mm、620mm、650mm、660mm、670mm、680mm或690mm。
19、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
20、本专利技术构建携带钙离子报告基因的工程化细胞，可进一步诱导分化为携带钙离子报告基因的神经元，能够实现大批量制备标准化的钙成像神经元，经氯化钾溶液验证了该神经元能够对钙离子作出响应，荧光强度增加，是良好的钙成像工具，解决目前神经元钙成像实验操作繁琐、对细胞培养环境影响较大等问题，实现在同一株细胞上研究功能紊乱和结构变化。
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1.一种携带钙离子报告基因的工程化细胞，其特征在于，所述工程化诱导多能干细胞为含有质粒的诱导多能干细胞；
2.根据权利要求1所述的携带钙离子报告基因的工程化细胞，其特征在于，所述诱导多能干细胞包括人源诱导多能干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的携带钙离子报告基因的工程化细胞，其特征在于，所述携带jGCaMP7s基因的质粒包括jGCaMP7s和/或pGP-CMV-jGCaMP7s。
4.一种携带钙离子报告基因的神经元，其特征在于，所述携带钙离子报告基因的神经元来源于权利要求1-3任一项所述的携带钙离子报告基因的工程化细胞；
5.一种制备权利要求1-3任一项所述的携带钙离子报告基因的工程化细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
6.一种权利要求4所述的携带钙离子报告基因的神经元的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
7.根据权利要求6所述的携带钙离子报告基因的神经元的制备方法，其特征在于，所述抗生素包括多西霉素和嘌呤霉素。
8.根据权利要求7所述的携带钙离子报告基因的神经元的制备方法，其特征在于
9.权利要求4所述的携带钙离子报告基因的神经元的在神经元钙成像中的应用。
10.一种神经元钙成像的方法，其特征在于，所述方法包括：
...【技术特征摘要】
1.一种携带钙离子报告基因的工程化细胞，其特征在于，所述工程化诱导多能干细胞为含有质粒的诱导多能干细胞；
2.根据权利要求1所述的携带钙离子报告基因的工程化细胞，其特征在于，所述诱导多能干细胞包括人源诱导多能干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的携带钙离子报告基因的工程化细胞，其特征在于，所述携带jgcamp7s基因的质粒包括jgcamp7s和/或pgp-cmv-jgcamp7s。
4.一种携带钙离子报告基因的神经元，其特征在于，所述携带钙离子报告基因的神经元来源于权利要求1-3任一项所述的携带钙离子报告基因的工程化细胞；
5.一种制备权利要求1-3任一项所述的携带...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗显钖，洪伟，李思瑶，陈瑞香，郭丽萍，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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