本发明专利技术公开了一种水稻抗除草剂突变基因及其应用。本发明专利技术通过从大量基因序列中诱变、筛选获得了一种对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂具有强抗性的突变型基因序列，并且通过该突变基因序列导入水稻中进行不同除草剂含量情况下的生长测试，证明本发明专利技术的突变型基因能够给水稻带来乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂抗(耐)性，这对于抗除草剂水稻的培育具有重要意义，具有重大的经济价值。此外，考虑到目前大部分种植户在除草剂使用过程中的超量使用情况，本发明专利技术对于超量使用除草剂情况下的抗性也进行了测试，对于超量使用本发明专利技术的突变型基因植株也具有良好的抗性。该抗除草剂突变基因可广泛应用于植物抗除草剂育种。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术和作物基因工程。具体地，本专利技术涉及一种水稻抗除草剂突变基因及其应用。
技术介绍
1、随着水稻种植目标朝高产、优质、低成本的方向发展，尤其是直播栽培的迅速发展，草害成为制约产量的重要因素之一。稻田杂草不仅直接造成水稻产量和品质的降低，而且是多种病虫害的宿源地，间接影响水稻的正常生长发育和产量形成。化学除草是目前控制稻田杂草的主要措施，常规除草剂因其作用机制不同而有不同的杀草谱，但是杂草稻的防治一直是个难点，主要原因是杂草稻在分类学和生理学上都与水稻十分相似，除草剂使用不当会对作物产生重大药害。
2、因此，植物除草剂品种的开发朝向更精细化的发展。通过允许使用除草剂来控制杂草生长而不损伤作物本身，那么创制具有抗性植物、植物组织、植物种子可以有效的解决该类问题。
3、乙酰辅酶a羧化酶(accase)是植物脂肪酸生物合成的关键酶，它催化atp依赖乙酰辅酶a羧化作用诱导脂肪酸与类黄酮生物合成中的一种关键代谢产物——丙二酸单酰辅酶a，这是植物中脂肪酸生物合成的首要关键步骤，然后在脂肪酸合成酶作用下形成脂肪酸。若丙二酸单酰辅酶a的合成停止，则对accase的抑制将使植物丧失这种中间产物，导致膜结构的破坏，透性增强，细胞破坏。农药公司以accase为靶标，开发研制了一系列除草剂，在市场推广至今。
4、但是除草剂的过量使用现象不断发生，种植者为了保证水稻中杂草的有效抑制往往愿意过量使用除草剂，以达到增产的效果。除草剂的过量使用有时可能适得其反，容易对水稻自身带来损害，影响其发育和结实。</p>5、因此，加快各类除草剂抗性水稻种质创制与利用具有重要的意义。近年提出配套使用专用除草剂和抗除草剂水稻品种来控制稻田杂草的防治策略，因而抗除草剂水稻受到越来越多的关注，并成为遗传育种的一个重要方向。通过筛选优异的植物内源除草剂抗性位点，降低除草剂施用带来的风险，以及选育适合不同种植地区的抗除草剂优质水稻品种。随着分子生物学和现代生物技术的发展，抗除草剂水稻的研发和应用将会得到进一步完善和提升。
技术实现思路
1、技术问题：本专利技术所要解决的技术问题是提供一种水稻抗除草剂突变基因、相应表达盒和载体，并且提供上述基因、表达盒和载体在水稻中的应用。本专利技术的抗除草剂突变基因可以为水稻提供优良的耐除草剂性状，甚至可以耐受高倍剂量的除草剂使用，避免除草剂对于水稻自身的损伤。
2、本专利技术的基因序列是通过从水稻基因中通过大量、不断地尝试诱变、筛选中获得的、能够为植株带来强除草剂抗性的基因序列。本专利技术的基因序列有两种突变方式，一种是野生型水稻accase的核苷酸序列的第6155位点核苷酸发生突变，由t变成a，另一种是第6155、6156位的核苷酸发生突变，分别由t突变为a、t突变为c。野生型accase的核苷酸序列如序列表中seq id no:1中所示，突变后的序列如序列表中seq id no:2或3所示。突变后的基因序列可以赋予植物抗(耐)乙酰辅酶a羧化酶类除草剂抗性。
3、具体而言，一方面，本专利技术提供一种水稻抗除草剂突变基因，所述抗除草剂突变基因的核苷酸序列如序列表中seq id no.2或seq id no.3所示。
4、本专利技术还提供了一种表达盒，所述表达盒中含有所述的抗除草剂突变基因。
5、本专利技术还提供了一种重组载体，所述重组载体中含有所述的抗除草剂突变基因。
6、其中，所述抗除草剂突变基因具有对乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂的抗性。
7、本专利技术还提供了一种所述的抗除草剂突变基因、所述的表达盒、所述的重组载体在植物抗除草剂中的应用，所述应用包括将所述抗除草剂突变基因、所述表达盒以及所述重组载体导入目标植物的基因组中，以使所述目标植物具有对除草剂的抗性。
8、所述应用包括获得含有所述抗除草剂突变基因的水稻植株，将含有所述抗除草剂突变基因的水稻植株与目标品种的水稻植株杂交、回交使得所述目标水稻品种的水稻植株的后代含有所述抗除草剂突变基因。
9、本专利技术还提供了一种获取耐受除草剂的水稻植株的方法，包括如下步骤：
10、(1)选择水稻acc基因中的核苷酸序列seq id no:1中ggacaaagagatctttttgaagg序列为识别位点，设计pegrna序列；
11、(2)通过合成pegrna正向寡核苷酸链和可与之互补的反向寡核苷酸链，退火形成双链后，以goldengate克隆方式连接至bsaⅰ-hfv2酶预切过的引导编辑工具epe2的载体上，并转入大肠杆菌中；
12、(3)通过选择具有卡那霉素抗性且不具壮观霉素抗性的菌斑，获得阳性转化子，经测序验证后，提取阳性质粒，命名为epe2-acc1和epe2-acc2，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌；
13、(4)成熟水稻种子进行处理后，沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上，暗培养后，将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养，用于农杆菌转化；
14、(5)采用步骤(3)中转入了表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，经过侵染、筛选、分化、再生，得到转基因水稻植株。
15、其中，pegrna基因为pegrna1:
16、ggacaaagagatctttttgagtttcagagctatgctggaaacagcatagcaagttgaaataaggctagtccgttatcaacttgaaa aagtggcaccgagtcggtgcgccagcctgaagatttccttcaaaaagatctcttaataattcttgacgcggttcta tctagttacgcgttaaaccaactagaaa；
17、或者
18、pegrna2:
19、ggacaaagagatctttttgagtttcagagctatgctggaaacagcatagcaagttgaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaa agtggcaccgagtcggtgcgccagcctgaaggtttccttcaaaaagatctcttaataattcttgacgcggttcta tctagttacgcgttaaaccaactagaaa。
20、本专利技术还提供了一种获得具有除草剂抗性的水稻植株的方法，所述方法包括：通过基因编辑、转基因、诱变、杂交、回交或无性繁殖使得目标品种的水稻植株中包含所述的抗除草剂突变基因、所述的表达盒、或者所述的重组载体。
21、本专利技术还提供一种鉴定所述方法获得的植株的方法，该方法包括测定所述植物的植株中是否包含所述的抗除草剂突变基因。
22、本专利技术还提供一种控制稻田杂草的方法，对包含所述accase突变位点的作物，施用有效剂量或者有效剂量8倍的除草剂，所述除草剂包含盖草能、烯草酮、唑啉草酯中的一种或多种。
23、本专利技术的目的是使植物获得一本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种水稻抗除草剂突变基因，其特征在于，所述抗除草剂突变基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中含有权利要求1所述的抗除草剂突变基因。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中含有权利要求1所述的抗除草剂突变基因。
4.根据权利要求1中所述的抗除草剂突变基因、权利要求2所述的表达盒、或者权利要求3所述的重组载体，其中，所述抗除草剂突变基因具有对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂的抗性。
5.一种权利要求1中所述的抗除草剂突变基因、权利要求2所述的表达盒、权利要求3所述的重组载体在植物抗除草剂中的应用，其特征在于，所述应用包括将所述抗除草剂突变基因、所述表达盒以及所述重组载体导入目标植物的基因组中，以使所述目标植物具有对除草剂的抗性。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括获得含有所述抗除草剂突变基因的水稻植株，将含有所述抗除草剂突变基因的水稻植株与目标品种的水稻植株杂交、回交使得所述目标水稻品种的水稻植株的后代含有所述抗除草剂突变基因。
7.一种获取耐受除草剂的水稻植株的方法，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的获取耐受除草剂的水稻植株的方法，其中，pegRNA基因为pegRNA1:
9.一种获得具有除草剂抗性的水稻植株的方法，其特征在于，所述方法包括：通过基因编辑、诱变、杂交、回交或无性繁殖使得目标品种的水稻植株中包含权利要求1所述的抗除草剂突变基因、权利要求2所述的表达盒、或者权利要求3所述的重组载体。
10.一种鉴定权利要求7-9之一所述方法获得的植株的方法，其特征在于，所述方法包括测定所述植物的植株中是否包含权利要求1所述的抗除草剂突变基因。
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【技术特征摘要】
1.一种水稻抗除草剂突变基因，其特征在于，所述抗除草剂突变基因的核苷酸序列如序列表中seq id no.2或seq id no.3所示。
2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中含有权利要求1所述的抗除草剂突变基因。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中含有权利要求1所述的抗除草剂突变基因。
4.根据权利要求1中所述的抗除草剂突变基因、权利要求2所述的表达盒、或者权利要求3所述的重组载体，其中，所述抗除草剂突变基因具有对乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂的抗性。
5.一种权利要求1中所述的抗除草剂突变基因、权利要求2所述的表达盒、权利要求3所述的重组载体在植物抗除草剂中的应用，其特征在于，所述应用包括将所述抗除草剂突变基因、所述表达盒以及所述重组载体导入目标植物的基因组中，以使所述目标植物具有对除草剂的抗性。
6.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏鹏程，刘小双，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：
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