【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及中药质量控制与评价，具体是一种基于抗肾炎生物效价测定的冬虫夏草品质评价方法及应用。
技术介绍
1、冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌cordyceps sinensis(berk.)sacc.与蝙蝠蛾科昆虫幼虫上共生形成的干燥虫菌复合体，具有补肾益肺，止血化痰的功效，可应用于腰膝酸痛等。冬虫夏草含有多种活性成分，其中蛋白含量在20％左右，多糖0.2％，腺苷含量不低于0.01％。因此，蛋白类成分是冬虫夏草中的主要成分。然而，历版的《中国药典》对于冬虫夏草的质量评价方法没有做出确切规定，含量检测项只规定了冬虫夏草的腺苷含量，并规定本品含腺苷(c10h13n5o4)不得少于0.010％。但腺苷并不是冬虫夏草发挥“补肾益肺”的主要活性成分。尚未建立与冬虫夏草功效相关联的质量控制与评价方法，因此建立一种基于生物活性的冬虫夏草质量控制与评价方法具有实际意义。
2、相比化学药物而言，天然药物成分复杂，其质量标准的现代化与国际化一直困扰中药发展的核心，而建立科学、可靠的质量控制与评价方法是完善质量标准的关键。现阶段中药质量的控制与评价以化学成分的定性定量分析为主要手段。以个别或部分指标性成分的含量作为质量评价的一项指标，虽然可以控制指标性成分的含量，但中药成分复杂，单一或某些成分的含量，难以保证临床疗效的稳定发挥，更难以体现中药体系的整体生物效应。生物效价是以生物评价为核心的整合评价方法，可反映中药产品的整体活性，并关联中药功效，适用于化学物质基础不明确或不能反映其临床生物活性的中药。中药生物效价检测方法是通过与中药有效
3、综上所述，目前亟需构建一种基于生物活性的冬虫夏草的质量控制与评价方法，建立冬虫夏草基于功效的评价模式。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于抗肾炎生物效价测定的冬虫夏草品质评价方法及应用，以至少达到能够稳定、准确、可靠的对冬虫夏草抗炎生物活性进行质量控制和评价。
2、一种基于抗肾炎生物效价测定的冬虫夏草品质评价方法，包括以下步骤：
3、s1：诱导足细胞发生炎症反应，得到炎症小体模型；
4、s2：将待测冬虫夏草样品进行预处理，然后加入所述炎症小体模型进行常规培养；
5、s3：经过常规培养后，收集所述炎症小体模型中的干预后足细胞，提取总rna并合成cdna，进行qrt-pcr分析，得到抑制率；
6、所述足细胞为mcp-5；
7、所述诱导足细胞发生炎症反应的方法为：通过lps和mir-155-5诱导所述足细胞发生炎症反应。
8、进一步的，所述足细胞发生炎症反应的方法具体为：待状态稳定后以3×103cells/ml密度接种于96孔板中，24h，加入1.25-5μg/ml lps和10-20nm mir-155-5p诱导所述mpc-5细胞。
9、进一步的，所述炎症小体模型的稳定性通过测定炎症因子il-1β的相对表达量进行评估。
10、进一步的，步骤s2中，所述预处理的方法为：将所述待测冬虫夏草磨粉，提取总蛋白，将得到的提取液真空冻干，得到提取物粉末，将所述提取物粉末溶于细胞培养基，然后用滤膜过滤，取滤液。
11、进一步的，所述细胞培养基为dmem培养基；和/或，所述滤膜为0.45μm微孔滤膜。
12、进一步的，步骤s2中，所述常规培养的时间为24h。
13、进一步的，评价方法还包括：设置调零组、空白组、模型组、阳性组以排除干扰。
14、进一步的，所述空白组、模型组、阳性组细胞计数后加入mpc-5的细胞悬液，进行常规培养；所述调零组及空白组继续给予完全培养液，所述给药组及阳性组分别给予含药培养液培养，干预结束后除所述调零组和空白组其他组由lps+mir-155-5p共同诱导培养24h，收集细胞，提取总rna并合成cdna，进行qrt-pcr分析，得到所述空白组、模型组以及阳性组的抑制率。
15、进一步的，所述的冬虫夏草品质评价方法，还包括：
16、s4：选取标准对照物质，设定基准生物效价，并根据所述抑制率计算所述冬虫夏草样品的相对生物效价。
17、进一步的，步骤s4中，所述标准对照物质为炎症小体抑制剂mcc-950。
18、进一步的，生物效价的计算方法为按照《药品生物检定》中的简化概率单位法的原理计算相对效价。
19、进一步的，所述生物效价的计算方法为：冬虫夏草生物效价、ic50值及实验误差是按照2020年版《中国药典》生物检定统计法项下的直接测定法，利用生物效价计算软件计算。
20、具体为：将所述冬虫夏草样品的质量浓度(mg/ml)和所述抑制率(％)输入生物效价计算软件，计算生物效价(pt)及可信限率(fl，％)。
21、进一步的，所述生物效价计算软件为药典生物检定统计bs2000软件。
22、进一步的，所述冬虫夏草品质评价方法用于评价冬虫夏草抑肾炎功效以及其他抗肾炎中药之间的活性强弱。
23、进一步的，所述评价方法还包括：对活性强弱分级。
24、进一步的，所述分级方法为：根据冬虫夏草抗肾炎生物效价分级为优、良、可、劣；抗肾炎生物效价低于45.13u/mg为劣，高于45.13u/mg且低于60.18u/mg为可，高于60.18u/mg且低于90.26u/mg为良，高于90.26u/mg为优。
25、值得注意的是，所述活性强弱分级是通过取多批冬虫夏草抗肾炎生物效价的平均值75.22ui/mg的120％、80％、60％作为分级线。
26、本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
27、本专利技术的有益效果是：
28、1)本专利技术将lps与mir-155-5p结合，建立了稳定的肾炎模型，对il-1β具有较高的mrna相对表达量。
29、2)本专利技术通过检测对炎症因子的抑制率，从而转化成抗炎生物效价，操作方法简单、耗时短；经过方法学考察该方法稳定性高，准确度高，可靠性高，所选的肾足细胞来源于肾脏，与冬虫夏草发挥抗肾炎药效相关，可有效表征冬虫夏草的抗肾炎活性。本专利技术有效解决了基于生物活性测定的冬虫夏草的质量评价，保证冬虫夏草的临床用药安全性，作为冬虫夏草通过含量测定来评价质量的补充和提高，将冬虫夏草的质量与药效相关联，把控冬虫夏草的内在质量，完善现行质量管理办法，并为其他类似中药的质量评价和控制提供新的研究思路和技术参考。
30、3)本专利技术通过检测不同批次本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于抗肾炎生物效价测定的冬虫夏草品质评价方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的冬虫夏草品质评价方法，其特征在于：所述足细胞发生炎症反应的方法具体为：培养所述MPC-5细胞，待状态稳定后以3×103cells/mL密度接种于96孔板中，24h，加入1.25-5μg/mL LPS和10-20nM MiR-155-5p诱导所述MPC-5细胞。
3.根据权利要求1所述的冬虫夏草品质评价方法，其特征在于：所述炎症小体模型的稳定性通过测定炎症因子IL-1β的相对表达量进行评估。
4.根据权利要求1所述的冬虫夏草品质评价方法，其特征在于：步骤S2中，所述预处理的方法为：将所述待测冬虫夏草磨粉，提取总蛋白，将得到的提取液真空冻干，得到提取物粉末，将所述提取物粉末溶于细胞培养基，然后用滤膜过滤，取滤液。
5.根据权利要求4所述的冬虫夏草品质评价方法，其特征在于：所述细胞培养基为DMEM培养基。
6.根据权利要求4所述的冬虫夏草品质评价方法，其特征在于：所述滤膜为0.45μm微孔滤膜。
7.根据权利要求1所述
8.根据权利要求1所述的冬虫夏草品质评价方法，其特征在于，还包括：
9.根据权利要求8所述的冬虫夏草品质评价方法，其特征在于：步骤S4中，所述标准对照物质为炎症小体抑制剂MCC-950。
10.如权利要求1-9任一项所述冬虫夏草品质评价方法的应用，其特征在于：所述冬虫夏草品质评价方法用于评价抗肾炎中药的抑肾炎功效。
...【技术特征摘要】
1.一种基于抗肾炎生物效价测定的冬虫夏草品质评价方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的冬虫夏草品质评价方法，其特征在于：所述足细胞发生炎症反应的方法具体为：培养所述mpc-5细胞，待状态稳定后以3×103cells/ml密度接种于96孔板中，24h，加入1.25-5μg/ml lps和10-20nm mir-155-5p诱导所述mpc-5细胞。
3.根据权利要求1所述的冬虫夏草品质评价方法，其特征在于：所述炎症小体模型的稳定性通过测定炎症因子il-1β的相对表达量进行评估。
4.根据权利要求1所述的冬虫夏草品质评价方法，其特征在于：步骤s2中，所述预处理的方法为：将所述待测冬虫夏草磨粉，提取总蛋白，将得到的提取液真空冻干，得到提取物粉末，将所述提取物粉末溶...
【专利技术属性】
技术研发人员：国锦琳，何丽英，刘思静，周小仝，牛舒琪，廖郑悦，白静，
申请(专利权)人：成都中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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