【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生药鉴别，具体涉及一一种用于鉴别金线兰和浙江金钱兰的pcr引物及鉴别方法。
技术介绍
1、金钱兰和浙江金钱兰都属于兰科金线兰属的植物，它们在中国的传统医学中都有着悠久的应用历史，因其药用价值而备受重视。以下是两者的简要介绍和区别，金钱兰是多年生草本植物，生长在温带地区的森林、草地和沼泽地；花朵呈黄绿色，具有独特的香气，主要分布在长江流域及其以南地区。浙江金钱兰与金钱兰相似，但可能在花朵的颜色和形状上有所区别，主要分布在中国浙江省等地。
2、在当前的生药鉴定领域，传统的金线兰与浙江金线兰鉴别方法主要依赖于形态学特征和化学成分分析，这些方法存在一定的局限性，如形态特征受环境影响较大，化学分析过程复杂且成本高，且缺乏标准化的鉴定流程，导致结果的可比性和重复性受限。此外，这些传统方法往往无法准确揭示植物间的遗传分化，限制了其在精确鉴别中的应用。金线兰与浙江金线兰作为药用植物，其真伪鉴别对于保障药品质量和疗效具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种用于鉴别金线兰和浙江金钱兰的pcr引物及鉴别方法，旨在解决现有技术中鉴别金线兰与浙江金线兰的方法精确性低的技术问题。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案为：
3、第一方面，本专利技术提供了一种用于鉴别金线兰和浙江金钱兰的引物，包括如下所示的四对特异性引物：
4、引物对1：seq id no.1：5′-gcgtacgtatcaggaacgaag-3′；>
5、seq id no.2：5′-ggagtagagcagtttggtagct-3′；
6、引物对2：seq id no.3：5′-gtactgttgatcttttgcatccg-3′；
7、seq id no.4：5′-ggtattggaccttccatagcag-3′；
8、引物对3：seq id no.5：5′-gaggagcagttttgtttcactc-3′；
9、seq id no.6：5′-ggtattggaccttccatagcag-3′；
10、引物对4：seq id no.7：5′-ctatctggtttaactcatcgaactg-3′；
11、seq id no.8：5′-tacgagctgcagctcaatc-3′。
12、第二方面，本专利技术提供了一种用于生药鉴别金线兰和浙江金钱兰的方法，包括：
13、s1、dna提取：从幼嫩叶片或叶片干样中提取叶绿体dna样本；
14、s2、pcr扩增：设计若干组引物分别对金钱兰的dna样本和浙江金钱兰的dna样本标记进行pcr扩增获得pcr产物；
15、所述引物对为引物对1、引物对2、引物对3或引物对4；
16、所述引物对1为：seq id no.1：5′-gcgtacgtatcaggaacgaag-3′；
17、seq id no.2：5′-ggagtagagcagtttggtagct-3′；
18、所述引物对2为：seq id no.1：5′-gcgtacgtatcaggaacgaag-3′；
19、seq id no.2：5′-ggagtagagcagtttggtagct-3′；
20、引物对3为：seq id no.1：5'-gcgtacgtatcaggaacgaag-3′；
21、seq id no.2：5'-ggagtagagcagtttggtagct-3′；
22、所述引物对4为：seq id no.7：5'-ctatctggtttaactcatcgaactg-3′；
23、seq id no.8∶5′-tacgagctgcagctcaatc-3'；
24、s3、分离dna片段：将金钱兰的pcr产物和浙江金钱兰的pcr产物进行凝胶电泳；s4、鉴别金钱兰和浙江金钱兰：将金钱兰的电泳图和浙江金钱兰的电泳图进行对比，若金钱兰的电泳图和浙江金钱兰的电泳图相同，则为同一品种；若金钱兰的电泳图和浙江金钱兰的电泳图不相同；则为不同品种。
25、优选的方案，在步骤s1中，所述dna提取方法为：
26、s100、组织研磨：准备100-300质量份的幼嫩叶片或18-22质量份的干叶片，放入含有2-4mm直径研磨钢珠的离心管中，并置于液氮中1.5-2.5min，再将离心管放入高速组织研磨仪中以40-50hz研磨1.5-2.5min获得细粉；
27、s200、将所述细粉放入含有缓冲液和核糖核酸酶a的离心管中旋涡振荡，然后在60-70℃水浴中加热8-12分钟，加热过程中颠倒离心管2-3次获得加热后的样品；向加热后的样品中加入130体积份缓冲液ap2，充分混匀后冰上放置4-6分钟，离心后吸取550-650体积份上清液到离心管中；
28、s300、沉淀dna：向所述上清液中加入1.5倍体积的ap3缓冲液，立即混匀后加入吸附柱ac中，离心并倒掉废液；
29、s400、洗脱dna：清洗吸附柱后，在吸附膜上加50体积份-100体积份的洗脱缓冲液eb，室温放置3-5分钟，离心后收集dna，并置于零下18-22℃保存。
30、其中，1质量份：1体积份＝1mg：lul。
31、基于上述方案，所述的dna提取方法通过组织研磨和裂解步骤有效释放dna，利用核糖核酸酶a去除rna污染，并通过吸附柱ac的沉淀和洗脱步骤实现dna的高纯度回收，该方法操作简便、快速高效，同时保证了dna的完整性和稳定性，适用于后续的分子生物学研究和遗传分析，为确保试验结果的准确性和重复性提供了有力保障，且低温保存步骤延长了dna的保存期限，便于长期存储和后续使用。
32、优选的方案，在步骤s100中，准备200质量份的幼嫩叶片或20质量份的干叶片，放入含有3mm直径研磨钢珠的离心管中，并置于液氮中2min，再将离心管放入高速组织研磨仪中以45hz研磨2min获得细粉。
33、基于上述方案，液氮的低温可以迅速使植物细胞破裂，保持dna的完整性，避免高温可能引起的dna降解；其次，高速研磨能够充分破碎细胞壁和细胞膜，释放出更多的dna；再者，使用3mm直径的研磨钢珠可以增加研磨效率，提高dna的提取量；此外，45hz的频率和2分钟的研磨时间是优化后的条件，能够确保细胞充分裂解的同时减少dna的机械损伤，为后续的dna提取和分析提供高质量的模板，从而提高试验的准确性和重复性。
34、优选的方案，在步骤s2中，所述pcr扩增的步骤为：
35、a1、pcr反应体系构建：依次分别将1体积份模板、1体积份正向引物、1体积份反向引物、10体积份水和10体积份高保真taq酶加入离心管中，并在微型离心机中12000rpm离心5-10秒；
36、a2、pcr扩增：使用梯度pcr仪进行扩增，9本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鉴别金线兰和浙江金钱兰的引物，其特征在于，包括如下所示的引物对：
2.一种用于生药鉴别金线兰和浙江金钱兰的方法，其特征在于，包括：
3.根据权利要求2所述的一种用于生药鉴别金线兰和浙江金钱兰的方法，其特征在于：在步骤S1中，所述DNA提取方法为：
4.根据权利要求3所述的一种用于生药鉴别金线兰和浙江金钱兰的方法，其特征在于：在步骤S100中，准备200质量份的幼嫩叶片或20质量份的干叶片，放入含有3mm直径研磨钢珠的离心管中，并置于液氮中2min，再将离心管放入高速组织研磨仪中以45Hz研磨2min获得细粉。
5.根据权利要求2所述的一种用于生药鉴别金线兰和浙江金钱兰的方法，其特征在于：在步骤S2中，所述PCR扩增的步骤为：
6.根据权利要求2所述的一种用于生药鉴别金线兰和浙江金钱兰的方法，其特征在于：在步骤A2中，使用梯度PCR仪进行扩增，95℃预变性5min，95℃变性15s，各引物退火15s，72℃延伸1min，变性、退火、延伸过程循环35次，72℃再次延伸10min，4℃保存。
7.根据权
8.根据权利要求7所述的一种用于生药鉴别金线兰和浙江金钱兰的方法，其特征在于：在步骤B2中，每个加样孔加入10ul PCR产物。
9.根据权利要求7所述的一种用于生药鉴别金线兰和浙江金钱兰的方法，其特征在于：在步骤B2中，所述DNA分子量标准选用100-2000bp。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括以下至少一对引物对：
...【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别金线兰和浙江金钱兰的引物，其特征在于，包括如下所示的引物对：
2.一种用于生药鉴别金线兰和浙江金钱兰的方法，其特征在于，包括：
3.根据权利要求2所述的一种用于生药鉴别金线兰和浙江金钱兰的方法，其特征在于：在步骤s1中，所述dna提取方法为：
4.根据权利要求3所述的一种用于生药鉴别金线兰和浙江金钱兰的方法，其特征在于：在步骤s100中，准备200质量份的幼嫩叶片或20质量份的干叶片，放入含有3mm直径研磨钢珠的离心管中，并置于液氮中2min，再将离心管放入高速组织研磨仪中以45hz研磨2min获得细粉。
5.根据权利要求2所述的一种用于生药鉴别金线兰和浙江金钱兰的方法，其特征在于：在步骤s2中，所述pcr扩增的步骤为：
6.根据权利要求2所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：方静，孔向军，吴梅，方莉，郑祎晨，徐金晶，
申请(专利权)人：金华市农业科学研究院浙江省农业机械研究院，
类型：发明
国别省市：
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