【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米孔检测领域，具体涉及一种利用生物埃米孔检测核苷酸的方法。
技术介绍
1、纳米孔单分子检测技术是一种集操作简单、灵敏度高、检测速度快、无需标记等优点的传感检测技术，广泛应用于蛋白质检测、基因测序和标志物检测等领域。目前，基因检测的费用、灵敏度和精度是该检测技术发展中亟待解决的主要问题，因此开发新型纳米孔材料是解决这些问题的关键手段。
2、生物纳米孔是一种自然形成纳米尺度的孔，其孔尺寸与许多重要的生物分子的大小相似。当分子通过纳米孔内部的通道时，特定的阻塞电流和易位事件产生。根据分子的阻塞电流和易位频率，可以实现对目标分子的定性和定量分析。因此，通道孔径大小是影响纳米孔的检测能力和应用范围的主导因素。一些具有合适通道孔径的蛋白质纳米孔已被用于纳米生物技术的应用，如α-溶血素(α-hemolysin，α-hl)、mspa、csgg、气单胞菌溶素(aerolysin)、phi29连接器等。这些生物纳米孔主要来自细菌孔蛋白或病毒门，并且有大约为单链dna(ssdna)或双链dna(dsdna)大小的孔径(1.0nm-3.6nm)。因此，它们适用于检测核酸，并已被用于dna/rna测序、核酸生物标记物检测和生物分子相互作用研究。然而，目前需要根据特定的应用需求对生物纳米孔进行局部修饰，如定点诱变或修饰特定的适配器等，才能适应更广泛的测序范围。以α-hl为例，其有限的孔径约1.4nm，因此应用范围仅限制在ssdna、rna或其他分子的分析中，通过利用环糊精(cyclodextrin)修饰，可用于直接检测单磷酸脱氧
3、作为生命文字的字母，单核苷酸dntps的排列包含了数量巨大的信息。dntps的这些多功能性不仅使它们成为遗传物质的组成部分，而且使其在dna探针、通过dna条形码(dna barcoding)的物种识别和dna计算(dnacomputing)的高效应用等方面成为可能。对于dntps的检测，传统技术包括hplc、荧光检测和qpcr，往往需要荧光标记或昂贵的设备。
4、综上所述，本专利技术提供了一种基于小电导机械力敏感性通道埃米孔来检测多种核苷酸的方法，埃米孔是一种尺寸比纳米孔更小的孔径蛋白质，以改善现有技术的不足。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种检测样本中核苷酸的方法，具体技术方案如下。
2、一种检测样本中核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
3、s1将所述样本加入埃米孔系统，所述埃米孔系统包括：埃米孔、绝缘膜、第一介质、第二介质，其中所述埃米孔被嵌入所述绝缘膜中，所述绝缘膜将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述埃米孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道，所述埃米孔为mscs埃米孔，所述埃米孔具有径向对称且形状似圆柱体的七聚体结构，所述七聚体结构包含7个侧面开口和1个底部开口；所述样本被加入到所述第一介质；
4、s2向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力，所述样本中的核苷酸与所述埃米孔相互作用并产生电信号；
5、s3分析所述电信号，进而识别所述样本中的核苷酸。
6、进一步地，所述开口的电荷性质和/或孔径大小是可调节的。
7、进一步地，所述开口的调节方式包括使所述绝缘膜受到机械力刺激和/或使所述绝缘膜的物理状态变化。
8、进一步地，所述机械力刺激包括所述绝缘膜两侧的介质的渗透压差变化、微针对所述绝缘膜的直接物理刺激和气压负压对所述绝缘膜的刺激中的一种或多种。
9、进一步地，所述开口的孔径可以根据以下方式来调节：
10、(1)所述第一介质和所述第二介质的种类选择；和/或
11、(2)所述第一介质与所述第二介质之间的渗透压差。
12、进一步地，所述第一介质与所述第二介质之间渗透压差是通过所述第一介质与所述第二介质之间的浓度差来调节的。
13、进一步地，所述第一介质与所述第二介质之间的浓度差为大约0-270mm。
14、进一步地，所述埃米孔为mscs变体埃米孔。
15、进一步地，所述mscs变体包括侧孔体积变体和/或侧孔电荷变体。
16、进一步地，所述埃米孔源自杆菌。
17、进一步地，所述埃米孔包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、腾冲嗜热厌氧菌和幽门螺杆菌中的一种或多种。
18、进一步地，所述埃米孔为pamscs变体埃米孔。所述pamscs变体埃米孔的突变位点位于所述pamscs的胞质区的侧面开口。
19、进一步地，所述pamscs变体埃米孔包括130a、130h、180r、271i、130s和130p中的一种或多种。
20、进一步地，所述核苷酸包括dgtp、datp、dttp、dctp、dutp、gtp、atp、ttp、ctp、utp中的一种或多种。
21、进一步地，所述绝缘膜包括磷脂膜和/或高分子膜。
22、进一步地，所述第一介质和/或所述第二介质包括氯化钠溶液、氯化锂溶液、氯化铯溶液、氯化钾溶液和溴化钠溶液中的一种或多种。
23、另一方面，本专利技术还提供了一种核苷酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
24、(1)mscs埃米孔；
25、(2)绝缘膜；
26、(3)电导液。
27、进一步地，所述mscs埃米孔包括mscs的侧孔体积变体和/或侧孔电荷变体。
28、进一步地，所述绝缘膜包括磷脂膜和/或高分子膜。
29、进一步地，所述电导液包括氯化钠溶液、氯化锂溶液、氯化铯溶液、氯化钾溶液和溴化钠溶液中的一种或多种。
30、进一步地，所述mscs埃米孔包括pamscs变体埃米孔。
31、进一步地，所述pamscs变体埃米孔包括130a、130h、180r、271i、130s和130p中的一种或多种。
32、与现有技术相比，本专利技术的有益效果：
33、本专利技术提供了一种利用埃米孔系统检测样本中核苷酸的方法，其中埃米孔系统包含mscs埃米孔。本专利技术创造性地利用小电导机械力敏感性通道(mechanosensitivechannel ofsmall conductance,mscs)的特性来检测样本中核苷酸，具体体现为：
34、1)mscs埃米孔的孔径狭窄。据估计，mscs埃米孔的孔径范围为～6-16埃米，远小于现有技术中常用的纳米孔(例如，α-溶血素纳米孔的孔径约为1.4-2.4nm，即14–24埃米)。
35、2)mscs埃米孔的孔径可调(也可以理解为结构灵活)。mscs埃米孔可在毫秒内将机械刺激转化为电信号或生化信号，从而引发通本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测样本中核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述开口的电荷性质和/或孔径大小是可调节的；所述开口的调节方式可选地包括使所述绝缘膜受到机械力刺激和/或使所述绝缘膜的物理状态变化，所述机械力刺激可选地包括所述绝缘膜两侧的介质的渗透压差变化、微针对所述绝缘膜的直接物理刺激和气压负压对所述绝缘膜的刺激中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述开口的孔径可以根据以下方式来调节：
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一介质与所述第二介质之间的渗透压差是通过所述第一介质与所述第二介质之间的浓度差来调节的，所述第一介质与所述第二介质之间的浓度差可选地为大约0-270mM。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述埃米孔为MscS变体埃米孔，所述MscS变体可选地包括侧孔体积变体和/或侧孔电荷变体。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述埃米孔源自杆菌，可选地包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、腾冲嗜热厌氧菌和幽门螺杆菌中的一种或多种。
7
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸包括dGTP、dATP、dTTP、dCTP、dUTP、GTP、ATP、TTP、CTP、UTP中的一种或多种。
9.一种核苷酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述埃米孔为PaMscS变体埃米孔，可选地包括130A、130H、180R、271I、130S和130P中的一种或多种。
...【技术特征摘要】
1.一种检测样本中核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述开口的电荷性质和/或孔径大小是可调节的；所述开口的调节方式可选地包括使所述绝缘膜受到机械力刺激和/或使所述绝缘膜的物理状态变化，所述机械力刺激可选地包括所述绝缘膜两侧的介质的渗透压差变化、微针对所述绝缘膜的直接物理刺激和气压负压对所述绝缘膜的刺激中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述开口的孔径可以根据以下方式来调节：
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一介质与所述第二介质之间的渗透压差是通过所述第一介质与所述第二介质之间的浓度差来调节的，所述第一介质与所述第二介质之间的浓度差可选地为大约0-270mm。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述埃米孔为mscs变体埃米孔，所述mscs变体可选地...
【专利技术属性】
技术研发人员：耿佳，包锐，陈慕天，魏于全，赵长健，李开菊，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：
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