【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种重组抑制素b抗原及其制备方法与应用。
技术介绍
1、抑制素是转化生长因子p(tgf-p)超家族成员之一，是由α和β两个亚单位构成的二聚体糖蛋白激素。α亚单位相对分子质量(mr)是20000，β亚单位相对分子质量(mr)是5000-15000，并有βa和βb两种亚型。α和β通过二硫键结合，形成抑制素a(αβa)和抑制素b(αβb)。研究发现抑制素a在男性血液循环中浓度低(<2 pg/ml)不易被检测到，且无生物学活性，而抑制素b（inh-b）则是血液循环中主要有生物活性的抑制素。
2、此外，在血液循环中inh-b还有多种分子形式存在，包括成熟(mr：32000)和不完全成熟(又称前体)的αβ二聚体分子及游离α亚基。游离α亚基缺乏生物活性。用酶联免疫吸附试验(elisa)还可检测出血浆中的α亚单位前蛋白(pro-αc)，该蛋白可能是与其他抑制素有交叉反应的前蛋白系列，又称之为免疫相关蛋白原 (pro-αc-ri)。βb亚基前体为1个由392个氨基酸(aa)残基组成的肽链，成熟βb亚基(115aa)位于此肽链的碳端。不同哺乳动物βb亚基全长编码区核苷酸序列的同源性大于80％，成熟区核苷酸序列的同源性大于90％，成熟区推导的氨基酸序列的同源性大于96％。
3、抑制素b(inh-b)由生殖系统细胞分泌产生，与生殖力有密切联系，具有调节生殖功能内分泌、旁分泌和自分泌的作用。其参与女性卵泡发育调控及男性精子的发生，在辅助生育治疗中，对卵巢功能评估、卵泡监测、预测无精症患者精子获得率
4、临床上检测血清或精浆中inh-b的方法有放射免疫分析(ria)法和酶联免疫吸附法(双抗体夹心elisa法)。ria法不能区分inh-a与inh-b以及无活性的抑制素。elisa法使用一对高度特异的抗体，仅与有功能的inh-b分子特异性结合。其特异性与敏感性完全能够满足科研和临床检测需要。新的βb亚单位单克隆抗体46a／f使inh-b的检测更加简化和灵敏，但尚未投入使用。elisa法使用一对高度特异的抗体，仅与有功能的inh-b分子特异性结合。其检测原理是用微孔包被的βb亚单位的单克隆抗体捕获抗原，再与检测抗体(与酶耦联的α亚单位的特异性单克隆抗体)结合并显色；虽然与inh-a会有0.5％的交叉反应，其特异性与敏感性完全能够满足科研和临床检测需要。
5、然而，目前尚无自主知识产权检测inh-b的实验诊断盒，仅有国外dsl和obi两家公司的产品。而国外进口的试剂盒价格昂贵，无法进行大规模的人群研究和评价。为此，依托于基因工程单克隆抗体和蛋白质表达平台探索双抗夹心法elisa抑制素b检测试剂盒的研发，探索设计一种双抗夹心法elisa试剂盒为临床快速、准确和方便地检测inh-b奠定基础。也可以为临床提供可靠的国人的参考值范围。
技术实现思路
1、解决的技术问题：针对上述技术问题，本专利技术提供一种重组抑制素b抗原及其制备方法与应用，能有效解决进口试剂盒价格昂贵，研究受限等不足之处。
2、技术方案：第一方面，本专利技术提供一种重组抑制素b抗原，包括α和β两个亚单位抗原，α亚单位的编码序列和β亚单位的编码序列分别融合trxa标签，实现可溶表达；表达一段时间后启动编码sumo蛋白酶的质粒表达，进行细胞内酶切，去除trxa标签，得到仅含his标签的α和β两个亚单元抗原；抗原α亚单元抗原的氨基酸序列如seq id no.1所示，β亚单元抗原的氨基酸序列如seq id no.2所示，trxa标签的氨基酸序列如seq id no.3所示，sumo蛋白酶的氨基酸序列如seq id no.4所示：
3、seq id no.1：
4、stplmswpwspsalrllqrppeepaahanchrvalnisfqelgwerwivyppsfifhychggcglhippnlslpvpgapptpaqpysllpgaqpccaalpgtmrplhvrttsdggysfkyetvpnlltqhcaci；
5、seq id no.2：
6、glecdgrtnlccrqqffidfrligwndwiiaptgyygnycegscpaylagvpgsassfhtavvnqyrmrglnpgtvnscciptklstmsmlyfddeynivkrdvpnmiveecgca；
7、seq id no.3：
8、msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanla；
9、seq id no.4：
10、lvpelnekdddqvqkalasrentqlmnrdnieitvrdfktlaprrwlndtiieffmkyiekstpntvafnsffytnlsergyqgvrrwmkrkktqidkldkiftpinlnqshwalgiidlkkktigyvdslsngpnamsfailtdlqkyvmeeskhtigedfdlihldcpqqpngydcgiyvcmntlygsadapldfdykdairmrrfiahliltdalk。
11、第二方面，本专利技术提供一种第一方面所述的重组抑制素b抗原的制备方法，包括以下步骤：
12、s1、抑制素b 的α和β亚单元表达质粒构建
13、s1-1、将trxa 的c端6xhis标签删除；
14、s1-2、将sumo蛋白酶的识别序列插入在肠激酶识别位点（enterokinase site）和多克隆位点（mcs）之间，其中sumo蛋白酶的识别序列的氨基酸序列如seq id no.5所示，
15、seq id no.5：
16、sdsevnqeakpevkpevkpethinlkvsdgsseiffkikkttplrrlmeafakrqgkemdslrflydgiriqadqtpedldmedndiieahreqigg；
17、s1-3、将抑制素b α亚单元（inha）和β亚单元（inhbb）分别插入上述载体多克隆位点；
18、s2、sumo蛋白酶表达质粒构建
19、s2-1、将pbad24载体中抗性标签氨苄青霉素替换为氯霉素；
20、s2-2、将sumo蛋白酶编码序列插入步骤1所述载体；
21、s3、抑制素b α和β亚单元蛋白表达纯化
22、s3-1、将α和β亚单元质粒分别与sumo蛋白酶表达质粒共转染bl21（de3）感受态细胞；
23、s3-2、挑取单克隆接种，待培养物od值为0.6-0.8时，加入0.1-1mm iptg，16℃诱导α或β亚单元蛋白表达，12-16h后，再加入0.5%-0.001%阿拉伯糖诱导sumo蛋白酶表达；...
【技术保护点】
1.一种重组抑制素B抗原，其特征在于：包括α和β两个亚单位抗原，α亚单位的编码序列和β亚单位的编码序列分别融合TrxA标签，实现可溶表达；表达一段时间后启动编码SUMO蛋白酶的质粒表达，进行细胞内酶切，去除TrxA标签，得到仅含His标签的α和β两个亚单元抗原；抗原α亚单元抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β亚单元抗原的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，TrxA标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，SUMO蛋白酶的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
2.一种权利要求1所述的重组抑制素B抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S1的具体操作包括以下步骤：
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S2的具体操作包括以下步骤：
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S3的具体操作包括以下步骤：
6.权利要求1所述的重组抑制素B抗原的应用，其特征在于，包括以下应用中的一种或多种：
【技术特征摘要】
1.一种重组抑制素b抗原，其特征在于：包括α和β两个亚单位抗原，α亚单位的编码序列和β亚单位的编码序列分别融合trxa标签，实现可溶表达；表达一段时间后启动编码sumo蛋白酶的质粒表达，进行细胞内酶切，去除trxa标签，得到仅含his标签的α和β两个亚单元抗原；抗原α亚单元抗原的氨基酸序列如seq id no.1所示，β亚单元抗原的氨基酸序列如seqid no.2所示，trxa标签的氨基酸序列如seq id no.3所示，sumo蛋白酶的氨基酸序列如seqid no.4...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄治中，杨廷亚，陈星宇，曹凌波，
申请(专利权)人：南京艾诺迪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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