【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物遗传转化，具体涉及一种根癌农杆菌介导的燕麦mir转化法。
技术介绍
1、燕麦为禾本科（ poaceae）燕麦属（ avena）一年生草本植物。它是世界范围广泛种植的粮食、饲料（草）作物。基于燕麦细胞中染色体组，结合其外部形态特征，目前全世界种植的燕麦共分为30个种(郑殿升.2010.中国燕麦种质资源研究现状及展望：燕麦和荞麦研究与发展.//第一届和第二届全国燕麦荞麦学术研讨会论文集,北京：中国农业科学技术出版社)。目前，采用不同的遗传转化方法，已建立起许多栽培种燕麦的遗传转化体系。国外有关燕麦的转基因研究进展，pathi和sprink已在2023年发表综述中进行了详细介绍(pathik.m., sprink t.from petri dish to field: plant tissue culture and geneticengineering of oats for improved agriculturaloutcomes. plants (basel).2023,12(21):3782)。国内也有燕麦转基因的相关报道(张艺（2007）.燕麦遗传转化体系的建立和披碱草再生体系的建立[d].四川大学,2007.；王迅婧（2012）.燕麦组织培养和农杆菌介导的燕麦遗传转化体系的建立[d].东北师范大学,2012.；张丽君，刘龙龙，孙毅，张建珍，崔林.农杆菌介导的燕麦创伤胚转化体系研究[j].《河北农业科学》,2015,19（
2、基于双子叶植物具有经发根农杆菌（ agrobacterium rhizogenes）侵染后形成发根的特性以及这些发根具有根吸（root suckering，指的是从位于根上的不定芽原基发育形成不定芽）的现象，有关对双子叶植物不经过组培而直接进行基因呈递的cdb（cut-dip-budding）法已报道（cao x, xie h, song m, lu j, ma p, huang b, wang m, tian y,chen f, peng j, lang z,li g, zhu jk. cut-dip-budding delivery system enablesgenetic modifications in plants without tissue culture. innovation (camb).2022oct 25;4(1):100345.）。该遗传转化体系的建立，极大地促进了双子叶植物的转基因研究进程及其产业化应用。
3、cdb基因呈递方法的建立，基于长期以来科学家对农杆菌引起的农作物致病分子机理的解析。
4、研究发现，农杆菌之所以导致植物形成冠瘿瘤或发根，其分子机理在于：当双子叶植物不同器官受损伤后，其受损伤部位会分泌一种称之为乙酰丁香酮的化学物质；当土壤中有农杆菌（包括根癌和发根农杆菌）存在时，一旦感知到乙酰丁香酮，就会往植物受损伤部位聚集，并通过一系列复杂酶促反应，最终将农杆菌中一段称之为t-dna的片段转入到植物基因组中，并使得植物呈现为冠瘿瘤或发根的症状。上述农杆菌的致病机理，奠定了经农杆菌介导对植物进行高效、稳定转化的分子基础。
5、不同于双子叶植物，单子叶植物受损伤后，不具备自主分泌乙酰丁香酮的能力。因此，很长一段时间，农杆菌介导的植物转基因，仅局限于双子叶植物。1993年，研究发现，当往培养基中添加乙酰丁香酮时，根癌农杆菌也能完成单子叶植物水稻的转基因（chan mt,chang hh, ho sl, tong wf, yu sm. agrobacterium-mediated production oftransgenic riceplants expressing a chimeric alpha-amylase promoter/beta-glucuronidase gene. plant mol biol. 1993 jun;22(3):491-506.），由此使得以水稻、玉米、小麦等粮食作物的未成熟胚、成熟胚乃至成熟后完整的种子为材料，经组织培养获得胚性愈伤组织；再对这些胚性愈伤组织进行转化、筛选；并对筛选获得的抗性愈伤组织经芽诱导、根诱导，最终获得完整的转基因植株，成为了这些粮食作物转基因的主流技术。原因在于，相对于用基因枪对单子叶植物实施的遗传转化，根癌农杆菌介导的转化法具有转化率更高、转入外源基因多以单拷贝形式存在、并能稳定遗传表达等特点。但该方法显而易见的缺点就是需经历组织培养这一费时、费力、费钱的过程。并且，受遗传种质差异决定，针对一种材料建立的愈伤组织诱导、再生及后续遗传转化体系，当更换一个品种时，原有体系就不再适用。这严重限制了该技术在单子叶粮食作物转基因育种领域的推广应用。
6、燕麦为单子叶植物，其根系为须根系。迄今，未发现自燕麦单根须根上发育形成不定芽的现象。这表明，上述针对双子叶植物、用发根农杆菌介导的cdb基因呈递法，不适合用于燕麦的遗传转化。此外，不同于水稻、玉米、小麦、高粱、大麦等粮食作物，燕麦细胞中染色体倍性复杂，天然存在二倍体、四倍体、六倍体之分，由此使得世界范围栽培燕麦高达30多个种。可见，如果针对每一种燕麦，均单独建立起一套胚性愈伤诱导及后续根癌农杆菌介导的遗传转化技术体系，显然已无法满足燕麦产业高质量发展对燕麦种质创新所提出的迫切需求。
技术实现思路
1、燕麦遗传种质多样性导致目前还没有形成一套对世界种植不同种燕麦均能进行稳定、高效、快捷基因呈递的技术体系。为了解决上述技术问题，本专利技术提出了一种采用根癌农杆菌对不同基因型燕麦进行高效、快捷、稳定遗传转化的mir基因呈递法。
2、本专利技术基于燕麦具有刈割后再生的特性，提出一种对10～30日苗龄的燕麦苗进行刈割（mow），然后分别用带有外源基因如报告基因 egfp(enhanced green florescentprotein)、除草剂抗性基因 osahasδ548w((fang j, wan c, wang w, ma l, wang x,cheng c, zhou j, qiao y, wang x. engineering herbicide-tolerancericeexpressing an acetohydroxyacid synthase with a single amino aciddeletion. int j mol sci. 2020 feb 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种根癌农杆菌介导的燕麦MIR转化法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的一种根癌农杆菌介导的燕麦MIR转化法，其特征在于，步骤2中，制备阳性基因工程农杆菌菌液为：无菌条件下，将活化的基因工程农杆菌加到液体培养基中，即得；所述液体培养基为AAM液体培养基。
3.根据权利要求2所述的一种根癌农杆菌介导的燕麦MIR转化法，其特征在于，基因工程农杆菌的活化具体操作为：依次用YEB、AB固体平板对基因工程农杆菌加以活化；然后用AAM液体培养基制备转化菌液。
4.根据权利要求1所述的一种根癌农杆菌介导的燕麦MIR转化法，其特征在于，步骤2中，获得的阳性基因工程农杆菌菌液的OD600值介于0.4～0.6之间。
5.根据权利要求1所述的一种根癌农杆菌介导的燕麦MIR转化法，其特征在于，步骤3中，燕麦幼苗的培养具体如下：当燕麦种子萌发形成不定根，并且有一片真叶自胚芽鞘中伸展出来时，将幼苗移栽至瓶底含蛭石的容器中培养，所述蛭石用1/2MS液体培养基浸湿。
6.根据权利要求5所述的一种根癌农杆菌介导的燕麦MIR转化法，其特征在于
7.根据权利要求1所述的一种根癌农杆菌介导的燕麦MIR转化法，其特征在于，步骤3中，侵染时，基因工程农杆菌菌液中乙酰丁香酮的浓度为100μM；所述刈割是用将燕麦幼苗部分茎叶剪掉，预留2～5cm带根幼苗茎段。
8.根据权利要求1所述的一种根癌农杆菌介导的燕麦MIR转化法，其特征在于，步骤4中，所述共培养具体操作为：用N6-As液体培养基将培养容器中的滤纸浸湿，将转化后的燕麦茎段控干菌液，放置于滤纸上，然后避光于24℃植物人工气候培养箱共培养两天。
9.根据权利要求1所述的一种根癌农杆菌介导的燕麦MIR转化法，其特征在于，步骤5中，复苏培养具体为：将共培养后的燕麦材料移栽到蛭石充填的容器中，于光照培养室进行复苏培养，期间用1/2MS液体培养基补充营养，让转基因燕麦材料复苏。
10.根据权利要求1所述的一种根癌农杆菌介导的燕麦MIR转化法，其特征在于，步骤6中，将复苏后的燕麦经再生形成2叶1心再生幼苗时，进行移栽；移栽所用的基质由营养土和栽培土组成，营养土和栽培土的体积比为1:3。
...【技术特征摘要】
1.一种根癌农杆菌介导的燕麦mir转化法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的一种根癌农杆菌介导的燕麦mir转化法，其特征在于，步骤2中，制备阳性基因工程农杆菌菌液为：无菌条件下，将活化的基因工程农杆菌加到液体培养基中，即得；所述液体培养基为aam液体培养基。
3.根据权利要求2所述的一种根癌农杆菌介导的燕麦mir转化法，其特征在于，基因工程农杆菌的活化具体操作为：依次用yeb、ab固体平板对基因工程农杆菌加以活化；然后用aam液体培养基制备转化菌液。
4.根据权利要求1所述的一种根癌农杆菌介导的燕麦mir转化法，其特征在于，步骤2中，获得的阳性基因工程农杆菌菌液的od600值介于0.4～0.6之间。
5.根据权利要求1所述的一种根癌农杆菌介导的燕麦mir转化法，其特征在于，步骤3中，燕麦幼苗的培养具体如下：当燕麦种子萌发形成不定根，并且有一片真叶自胚芽鞘中伸展出来时，将幼苗移栽至瓶底含蛭石的容器中培养，所述蛭石用1/2ms液体培养基浸湿。
6.根据权利要求5所述的一种根癌农杆菌介导的燕麦mir转化法，...
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