本发明专利技术公开了一种内消旋二氨基庚二酸脱氢酶及其应用。所述酶为内消旋二氨基庚二酸脱氢酶，所述酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列。本发明专利技术发现了来源于韧皮类细菌酶DAPDH1以及来源于嗜热诺瓦克氏菌的酶DAPDH2具备催化草酰乙酸合成D‑天冬氨酸的功能，同时设计合成D‑天冬氨酸的方法，使用一锅法进行三酶级联反应，能将廉价的混旋天冬氨酸或者L‑天冬氨酸完全转化为高附加值的D‑天冬氨酸，实现绿色、环保、高效且低成本制备D‑天冬氨酸，具有广泛的工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种内消旋二氨基庚二酸脱氢酶及其应用。
技术介绍
1、d-天冬氨酸在医药和化妆品化工领域有着重要的作用，以d-天冬氨酸和阿莫西林为原料，可以合成具有半衰期长和血清蛋白结合率低的阿斯匹西林，且d-天冬氨酸能够抗氧化促进胶原蛋白的生成，减少皱纹和皮肤粗糙的形成。
2、当前酶法合成d-天冬氨酸上主要是通过手性拆分。有报道内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶可以高立体选择性地还原胺化短链2-酮酸如丙酮酸合成对应的d-氨基酸，如cn115786296a公开了一种内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，能高效催化草酰乙酸生成d-天冬氨酸，相较于野生型，对草酰乙酸的比酶活能提高约10.9倍；n-酰基-d-氨基酸氨基水解酶能够立体专一性的催化n-酰基-d-氨基酸水解生成d-氨基酸和脂肪酸，该酶已被应用到d-天冬氨酸的合成中；d-琥珀酰胺酶可以定向的水解n-琥珀酰-d-氨基酸生成琥珀酸和d-氨基酸，利用d-琥珀酰胺酶以n-琥珀酰-dl-天冬氨酸为底物合成d-天冬氨酸，但是其缺点很明显，产率低，产物光学纯度不高；l-氨基酸氧化酶能拆分混旋的氨基酸，从而获得d-氨基酸，产物往往有着较高的光学纯度，其中l-天冬氨酸氧化酶(ec1.4.3.16)被用来合成d-天冬氨酸，但其理论产率只有50％，这限值了l-氨基酸氧化酶合成d-氨基酸的工业应用。
3、综上所述，挖掘新的应用于合成d-天冬氨酸的酶，实现高效、低成本生产d-天冬氨酸，对于d-天冬氨酸应用领域具有重要意义。
技术实现思路
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p>1、针对现有技术的不足与实际需求，本专利技术提供一种内消旋二氨基庚二酸脱氢酶及其应用，本专利技术挖掘对草酰乙酸有催化活力的内消旋二氨基庚二酸脱氢酶，以实现高效、低成本生产d-天冬氨酸。2、为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种酶在催化草酰乙酸中的应用，所述酶为内消旋二氨基庚二酸脱氢酶，所述酶的氨基酸序列包括seq id no.1或seq id no.2所示的序列。
4、本专利技术中，首次发现来源于韧皮类细菌(firmicutes bacterium)的内消旋二氨基庚二酸脱氢酶dapdh1(氨基酸序列为seq id no.1，accessionnumer为nln19466.1)以及来源于嗜热诺瓦克氏菌(novibacillus thermophilus)的内消旋二氨基庚二酸脱氢酶dapdh2(氨基酸序列为seq id no.2，accessionnumer为wp_077718924.1)对草酰乙酸具有催化活力，能够催化其合成d-天冬氨酸，具备广阔的应用前景。
5、可以理解，本专利技术发现了来源于韧皮类细菌(firmicutes bacterium)的酶dapdh1以及来源于嗜热诺瓦克氏菌(novibacillus thermophilus)的酶dapdh2具备催化草酰乙酸合成d-天冬氨酸的功能，那么firmicutes bacterium、novibacillus thermophilus或相近菌株中的序列相似且功能与seq id no.1或seq id no.2所示序列相同或相似的酶均能预期其具备催化草酰乙酸的功能，此外，利用本领域通用技术手段对seq id no.1或seq idno.2所示序列进行取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基改造而获得的酶，同时功能与原蛋白相同或相似，亦可预期其具备催化草酰乙酸的功能。
6、seq id no.1：
7、maldnrlrvaiigygnvgryalkavqaapdmlltgvvrrdpktpqpselagvkvvsdirelpdtegallclptrlipqwaerilsmgintvdgydihgeladlrqrlhqvaqragsvavlscgwdpgtnsivralfelmaprgitytnygpgmslghtvavkaipgvkdalsvtipdgmgvhkravyvelepgadfqaiaeaiksdpyfvndetkvtqvedvenlidmgqgvflerkgvssetdnqlfrydirinnpaltaqimtaslraasrqkpgcytmleipvidflpgereslirrlv。
8、seq id no.2：
9、mnkvhkiavvgygnigkyavqalnrapdmelagvvrrarsardvppelagvpiatsidelegveaailatptrttpeyasdilskgihtvdsydihgeladvrrklddiakrhgsvaivsagwdpgtdsmirsmlefmapggvtytnfgpgmsmghsvavkaidgvkdalsmtiplgtgvhrrmvyveceagadfetvkekvladpyfvndethviqvddvqqlvdvgqgvsmerkgvsgathnqlfnfemrinnpaltsqvlvaaaratfkqqpgaytmievpiidfmygdreelikrlv。
10、第二方面，本专利技术提供第一方面中所述的酶在合成d-天冬氨酸中的应用。
11、第三方面，本专利技术提供一种合成d-天冬氨酸的方法，所述方法包括：
12、以草酰乙酸为底物，以第一方面中所述的酶为催化剂催化生成d-天冬氨酸。
13、优选地，所述方法包括：
14、将草酰乙酸、nadp+与第一方面中所述的酶混合，进行反应，得到d-天冬氨酸。
15、优选地，所述草酰乙酸、nadp+和催化剂的质量浓度比为1:0.1:(1～2.5)。
16、优选地，所述反应的温度为20～40℃，包括但不限于21℃、22℃、23℃、25℃、30℃、35℃、36℃、38℃或39℃时间为15～25h。
17、优选地，所述方法还包括辅酶循环的步骤，所述辅酶循环包括：
18、在反应体系中加入甲酸脱氢酶和/或者葡萄糖脱氢酶。
19、本专利技术中，设计辅酶循环的步骤，能够进一步回收辅酶，降低成本，同时提高底物转化率。
20、可以理解，本领域通用的甲酸脱氢酶或者葡萄糖脱氢酶均适用于本专利技术，例如可选择来源于粪肠球菌(enterococcusfaecalis)的甲酸脱氢酶fdh，氨基酸序列的accessionnumer为esu74154.1。
21、第四方面，本专利技术提供一种合成d-天冬氨酸的方法，所述方法包括：
22、以l-天冬氨酸和/或混旋天冬氨酸为底物，以草酰乙酸合成酶，以及第一方面中所述的酶为催化剂催化生成d-天冬氨酸。
23、所述草酰乙酸合成酶包括l-氨基酸脱氨酶和/或l-天冬氨酸转氨酶。
24、可以理解，本领域通用的l-氨基酸脱氨酶或l-天冬氨酸转氨酶均适用于本专利技术，例如所述l-氨基酸脱氨酶或l-天冬氨酸转氨酶可选择如下(a1)-(a14)中任一：
25、(a1)来源于奇异变形杆菌(proteus mirab本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种酶在催化草酰乙酸中的应用，所述酶为内消旋二氨基庚二酸脱氢酶；
2.权利要求1中所述的酶在合成D-天冬氨酸中的应用。
3.一种合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
4.根据权利要求3所述的合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
5.根据权利要求4所述的合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述草酰乙酸、NADP+和催化剂的质量浓度比为1:0.1:(1～2.5)。
6.根据权利要求4或5所述的合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述反应的温度为20～40℃，时间为15～25h。
7.根据权利要求3-6任一项所述的合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法还包括辅酶循环的步骤，所述辅酶循环包括：
8.一种合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
9.根据权利要求8所述的合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
10.根据权利要求8或9所述的合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法还包括辅酶循环的步骤，所述辅酶循环包括：p>...
【技术特征摘要】
1.一种酶在催化草酰乙酸中的应用，所述酶为内消旋二氨基庚二酸脱氢酶；
2.权利要求1中所述的酶在合成d-天冬氨酸中的应用。
3.一种合成d-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
4.根据权利要求3所述的合成d-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
5.根据权利要求4所述的合成d-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述草酰乙酸、nadp+和催化剂的质量浓度比为1:0.1:(1～2.5)。
6.根据权利要求4或5所述的合成d-天冬...
【专利技术属性】
技术研发人员：周峰，张跃，乐庸堂，
申请(专利权)人：上海腾卓药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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