本发明专利技术涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的腺苷脱氨酶诊断试剂（盒），同时本发明专利技术还涉及测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂（盒）主要成分包括：缓冲液、辅酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、氯化钾、氯化钙、色氨酸酶、色氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种腺苷脱氨酶诊断试剂(盒)，同时本专利技术还涉及测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法，属于医学检验测定
技术介绍
医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢 酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水，脑脊液鉴别诊断，重症联合免疫缺 陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鉴别的重要诊断标志。 腺苷脱氨酶的活性测定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。据申请人了 解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是腺苷(白色结晶粉末)+水(H。0)腺苷脱 fiS肌苷(Inosine) +氨离子(NH4+)，此反映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因 此可以通过测定此波长处吸光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大小。然而，此方法无 法用一般医院的可见光分析仪测定，而需要使用专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广 应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出 一 种利用间接酶循环扩增法(IndirectEnzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂(盒)，采用该试剂(盒)不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行腺苷脱氨酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本专利技术腺苷脱氨酶活性浓度测定方法如下 腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨 氨+丙酮酸+吲哚色氨酸酶/K+色氨酸+水 色胺酸+辅酶色胺酸脱氢酶/Ca2+ (吲哚-3-基)丙酮酸+氨 +还原型辅酶 这种方法应用腺苷脱氨酶(Adenosine Deaminase ;EC 3. 5. 4. 4)酶(偶)联色 氨酸酶(tryptoph,se ;EC 4. 1.99. 1)、色氨酸脱氢酶(Tryptophan dehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 19)酶促反应连续监测法。腺苷脱氨酶及色氨酸酶都作为作用酶，功能为将腺苷酶解 产生氨，再生成色氨酸。色氨酸脱氢酶作为循环酶色氨酸脱氢酶的酶促作用使色胺酸再次 产生氨，使氨可以不断的被重复循环利用。色氨酸脱氢酶又作为显色酶，将辅酶(在340nm 处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在 340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算腺苷脱氨酶的活性浓度大小 无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法，其辅酶可以 下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一 本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净 水，复溶后使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，起始吸光度《0. 1， 测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的体积比例为1/25，反 应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值 4180。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小。 实施例二本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为双试剂，包括 试剂l三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液lOOmmol/L50mmol/L 3mmol/L 4mmol/L 15mmol/L 12mmol/L 6mmol/L 4mmol/L 稳定剂 辅酶 腺苷 丙酮酸 口引哚 氯化钾 氯化钙 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷 稳定剂盐酸缓冲液lOOmmol/L 500,1/L 6000U/L 色氨酸脱氢酶 8000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间10分钟，起始吸光度《0. l，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测腺苷脱氨酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值2170。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小。 实施例三 本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50mmol/L 辅酶 3mmol/L 腺苷 4mmol/L 丙酮酸 15,1/L 喷哚 12mmol/L 氯化钾 6mmol/L 氯化f丐 4mmol/L 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 色氨酸脱氢酶 8000U/L 试剂3三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 色氨酸酶 6000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定腺苷脱氨酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间 10分钟，起始吸光度《0. l，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测腺苷脱氨酶样品与 试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间 大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值2170。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小。 申请人:经过实验验证，采用以上
技术实现思路
中记载的其他测定方法均能达到本专利技术 的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。 总之，实验证明采用本专利技术的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所 需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0. 0006 ;吸光度时间反应曲线应呈直 线下降；试剂可测有效(R > 0. 99)线形范围可达700U/L ;试剂测试的不准确度，其相对偏7差不超过±4% ;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2% ;试剂的灵敏度可 达0. 0046±0. 0023 A A/min/U/L ;试剂在2-8。C下保存，活性可以稳定一年；——本专利技术灵 敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。权利要求一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的腺苷脱氨酶活性浓度测定方法，其方法如下腺苷+水 腺苷脱氨酶 肌苷+氨氨+丙酮酸+吲哚 色氨酸酶/K+ 色氨酸+水色胺酸+辅酶 色胺酸脱氢酶/Ca2+ (吲哚-3-基)丙酮酸+氨 +还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的腺苷脱氨酶活性浓度测定方法，其方法如下： 腺苷＋水 腺苷脱氨酶 肌苷＋氨 氨＋丙酮酸＋吲哚 色氨酸酶／Ｋ↑［＋］色氨酸＋水 色胺酸＋辅酶 色胺酸脱氢酶／Ｃａ↑［２＋］（吲哚－３－基）丙酮酸＋氨＋还原型辅酶 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度上升的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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