【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及去甲基化酶alkbh5在创伤性脑损伤后神经炎症中的应用，属于生物医用。
技术介绍
1、创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury，tbi)以高发生率、高死亡率和高致残率业已成为世界诸多国家突出的公共健康和社会经济问题，并且是公认的45岁以下青壮年死亡的首位病因。目前重度tbi的死亡率可高达35％，而伤后的神经功能障碍发生率更是居高不下，给伤者及其家庭带来长期的经济负担和严重的精神压力。
2、tbi是一个复杂的病理转变过程，大体可分为以下两个阶段：①原发性脑损伤：脑实质在创伤打击瞬间所遭受的直接性机械应力损伤。这类损伤的严重程度，主要取决于初始作用力的大小和性质，打击方向以及损伤部位等外界因素。②继发性脑损伤：由原发损伤所导致的脑组织和细胞的一系列继发性病理生理改变，如颅内出血、脑组织和细胞水肿、颅内高压、血脑屏障破坏、氧化应激及神经炎症等。继发性脑损伤可在损伤后的数分钟内发生，持续时间长短不一，且具有显著的级联反应和叠加效应，可导致病情在原有损伤基础上进一步加重，甚至引发新的病理性转变。虽然，近年来神经影像学技术有了长足发展、加之多模态监护应用的普及，使得神经外科医生对tbi患者的病情判断及颅内出血、恶性颅内高压等手术方案选择更加及时和精准，一定程度上降低了tbi患者的急性期死亡率。但以上这些努力，仅仅是针对原发性损伤所致恶果所采取的补救性治疗措施。但对于原发性脑损伤及其所导致的脑实质继发性病理损害，尤其是对tbi所诱发的神经炎症反应等，则大多选择对症姑息治疗，目前尚缺乏确切且有针对性
3、小胶质细胞(microglia)作为中枢神经系统(central nervous system，cns)中所固有的一类免疫细胞，约占成年cns细胞总量的10-15％。该类细胞具有极高的可塑性及适应性，可根据神经系统不同发育阶段、区域分布特性、所处健康或疾病状态，表现出功能迥异的调控作用。研究发现，小胶质细胞同样也是tbi后神经炎症反应的主要调控及“触发点”。tbi事件发生伊始，受损的神经元或蛋白质会释放损伤相关模式分子(damageassociated molecular patterns，damps)及atp至组织间隙中，区域周边驻留的小胶质细胞则会迅速感知这些改变，进入激活状态，其放射状细胞突起逐渐转变成球状阿米巴样末端，动员迁移到受损区域进行碎片吞噬并促进髓鞘再生。同时，激活的小胶质细胞会引发大量炎症级联反应，刺激星形胶质细胞活化，诱导受损神经元启动细胞死亡程序并促使血脑屏障通透性增加。对tbi事件而言，以上效应有利于早期清除损伤区域的坏死组织，是cns组织受损后进行自我修复所必需的条件和前提，是一种重要的先天免疫防御反应。然而，如果这一“触发点”呈持续且不受控制的过度激活，则会为后续的修复过程带来截然相反的“消极效应”。
4、进一步研究证实，tbi事件等创伤刺激所诱发的细胞因子释放，不单会引起小胶质细胞的炎性活化。同时，也会刺激小胶质细胞内诸如nfκb/nlrp3及erk/mapk等炎症相关信号通路的活化，形成“正反馈”性调节回环，加剧小胶质细胞的进一步激活，直至细胞出现活化后的“失抑制”状态，炎性因子和细胞毒性介质呈持续性高水平释放，进而诱发血脑屏障的延迟修复及破坏，甚至造成神经元不可逆性死亡等恶性后果。而这种失调的小胶质细胞激活在tbi患者脑组织中可持续存在长达17年之久，其分泌的炎性因子(如il-6、tnf-α和mhc-ii等)则与中至重度tbi患者的长期生存预后呈显著负相关。因此，tbi后脑组织存在长期和过度的炎症反应，小胶质细胞在其中发挥重要作用。如何有效的遏制小胶质细胞中过度的炎性活化，探寻其潜在的调控机制，有望成为目前治疗tbi后神经炎症反应的关键“突破口”同时，发现新的保护与治疗策略，将有助于降低tbi患者死亡率和致残率，对改善患者生存预后具有十分重要的意义。
5、表观遗传(epigenetics)是指基因组dna序列不发生改变的前提下，对dna，rna以及组蛋白和染色质进行局部结构修饰，使其基因表达发生可遗传性改变，并由此导致表型变异，最终影响细胞分化发育及功能改变的遗传学机制。目前研究证实，表观遗传修饰在神经系统结构发育及相关疾病发生发展中，扮演着重要的调控角色。其中，n6-腺苷酸甲基化(n6-methyladenosine,m6a)，即rna分子腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰，作为真核生物rna上最常见的表观遗传学修饰类型，几乎参与了rna代谢的每个环节，包括mrna稳定、剪切、诱导出核和翻译的调控以及lncrna和mirna的生物合成等。在人类及其他多种哺乳动物神经系统发育过程中，更有超过25％的rna转录组水平调控存在m6a修饰。目前已知参与调控m6a修饰的蛋白主要包括以下三大类：①甲基转移酶(methyltransferase)：“编码器”(writers)，催化在rna上产生甲基化修饰的酶，代表基因如：mettl3/14、watp等；②去甲基化酶(demethylase)：“擦除器”(erasers)，负责去除甲基化修饰的酶，代表基因如：fto、alkbh5等；③甲基化识别蛋白(methylation binding protein)：“阅读器”(readers)，负责识别甲基化修饰位点并与之结合，调整rna结构，提高转录翻译效率或诱导其降解，代表基因如：ythdf1-3等。
6、随着相关研究的不断深入，rna-m6a修饰与神经系统相关疾病之间的关系，也开始逐渐受到关注。有文献发现，阿尔茨海默症模型大鼠脑组织海马区域存在显著mettl3高表达，这可能与tau蛋白过度磷酸化相关。脑缺血再灌注损伤模型中，fto能有效降低bcl-2的rna甲基化水平，稳定其转录翻译过程，增强神经元的抗凋亡能力。而ythdf1则能通过结合nf-κb转录水平甲基化识别位点，影响其mrna降解过程，发挥炎性抑制作用。而在tbi相关研究中，虽已有学者开展了以m6a高通量测序技术为基础的探索性生物信息学分析研究，但其仅是证明tbi后可能存在转录组m6a修饰水平的改变，而对其细胞亚型定位以及具体的调控功能作用等问题，并未做出有针对性的深入研究。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是：针对tbi后小胶质细胞神经炎症反应是继发性损伤的主要病理改变之一，几乎存在于脑损伤后的整个病理变化阶段，无法从根源上对其进行有效扼制的技术问题，本专利技术提供m6a去甲基化酶alkbh5在tbi后引发的神经炎症中的应用；本专利技术首次证实m6a去甲基化酶alkbh5能通过抑制小胶质细胞过度的神经炎症反应，进而影响tbi患者的疾病演化进程，促进tbi患者的神经功能修复及预后，本专利技术为创伤性脑损伤后神经炎症提供了新的潜在治疗靶点。
2、为了实现上本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.去甲基化酶ALKBH5作为靶点在制备或筛选用于治疗创伤性脑损伤后神经炎症的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括利用特异性促进或激活ALKBH5表达或活性的物质制备治疗创伤性脑损伤后神经炎症的药物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述促进或激活ALKBH5表达或活性的物质包括ALKBH5重组蛋白，能够特异性增加ALKBH5基因表达的核酸分子，包含所述核酸分子的重组载体或重组菌。
4.一种非诊断治疗目的实验性验证ALKBH5在抑制创伤性脑损伤后神经炎症中的应用或下调小胶质细胞中ALKBH5的表达在促进创伤性脑损伤后神经炎症中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤5中构建小胶质细胞特异性ALKBH5基因敲除小鼠的方法包括：在对ALKBH5的结构进行分析后，针对ALKBH5基因的转录本Transcript ID-ENSMUST00000044250.4采用CRISPR/Cas9基因编辑技术在exon1-exon2区域两端插入Loxp(locus of
6.小胶质细胞特异性ALKBH5基因敲除小鼠模型在研究ALKBH5对创伤性脑损伤后神经炎症的调控作用中的应用、在构建ALKBH5基因功能研究模型中的应用，其特征在于，所述ALKBH5基因敲除小鼠模型的构建方法包括：在对ALKBH5的结构进行分析后，针对ALKBH5基因的转录本Transcript ID-ENSMUST00000044250.4采用CRISPR/Cas9基因编辑技术在exon1-exon2区域两端插入Loxp(locus of X-over P1)的Cre酶剪切位点，并通过杂合子互配方式得到带有两个loxP位点的纯合子ALKBH5flox/flox小鼠，其后再将纯合子ALKBH5flox/flox小鼠与小胶质细胞特异性CX3CR1-CreERT2工具鼠交配繁育，通过他莫昔芬诱导，最终获得小胶质细胞特异性ALKBH5基因敲除小鼠ALKBH5MG-KO。
...【技术特征摘要】
1.去甲基化酶alkbh5作为靶点在制备或筛选用于治疗创伤性脑损伤后神经炎症的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括利用特异性促进或激活alkbh5表达或活性的物质制备治疗创伤性脑损伤后神经炎症的药物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述促进或激活alkbh5表达或活性的物质包括alkbh5重组蛋白，能够特异性增加alkbh5基因表达的核酸分子，包含所述核酸分子的重组载体或重组菌。
4.一种非诊断治疗目的实验性验证alkbh5在抑制创伤性脑损伤后神经炎症中的应用或下调小胶质细胞中alkbh5的表达在促进创伤性脑损伤后神经炎症中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤5中构建小胶质细胞特异性alkbh5基因敲除小鼠的方法包括：在对alkbh5的结构进行分析后，针对alkbh5基因的转录本transcript id-ensmust00000044250.4采用crispr/cas9基因编辑技术在exon1-exon2区域两端插入loxp(locus of x-over p1)的cre酶剪切位点，并通过杂合子互配方式...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡霖，田恒力，饶艳霞，彭勃，陈浩，李小钰，丁军，袁方，徐志明，牛鑫宇，魏来，
申请(专利权)人：上海市第六人民医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。