本发明专利技术公开了苦荞麦来源的磷酸激酶基因及其表达载体和应用。本发明专利技术从苦荞麦中分离得到磷酸激酶基因，所述基因的多核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明专利技术利用基因工程手段，将该磷酸激酶基因FtPAK遗传转化荞麦外植体获得过表达磷酸激酶基因FtPAK的转基因荞麦毛状根，相比野生型对照组，过表达磷酸激酶基因FtPAK苦荞麦毛状根中异斛皮苷含量显著增加，证明该磷酸激酶基因FtPAK能够调控植物体内异斛皮苷的生物合成。本发明专利技术在促进苦荞中黄酮类物质的生物合成以及在培育或选育高产黄酮类物质植物品种等方面具有应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物来源的磷酸激酶基因，尤其涉及从苦荞麦中分离得到的磷酸激酶基因及其表达载体，本专利技术进一步涉及所述基因及其表达载体在调控黄酮类物质生物合成中的应用，属于磷酸激酶基因及其应用领域。
技术介绍
1、苦荞麦为蓼科(polygonaceae)荞麦属(fagopyrum)的双子叶植物，是广为种植的栽培荞麦品种，含有丰富的次生代谢产物，如多酚类物质和黄酮类(花青素，芦丁、槲皮素、异斛皮苷等)。目前已报道有多种磷酸激酶参与植物黄酮代谢调控通路。磷酸激酶可以通过对其他蛋白的磷酸化协作调节类黄酮次生代谢生物合成途径中结构基因的表达，从而控制植物体内类黄酮的合成。
2、异槲皮苷作为苦荞麦中极为重要的次生代谢物，其具有抗菌和抗氧化特性以及降血压和降血糖功能。此外，对于植物来说，异斛皮苷可以保护植株免受太阳紫外线辐射、干燥、寒冷和害虫的伤害，因此对于异斛皮苷合成通路中调控基因的研究是十分必要的。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一是提供一种从苦荞麦中分离得到的磷酸激酶基因及其编码蛋白；
2、本专利技术的目的之二提供含有所述磷酸激酶基因的表达盒、重组表达载体或含有所述重组表达载体的重组宿主细胞；
3、本专利技术的目的之三将所述从苦荞麦中分离得到的磷酸激酶基因及其编码蛋白、含有所述磷酸激酶基因的表达盒、重组表达载体或含有所述重组表达载体的重组宿主细胞等应用于催化黄酮类化合物的合成。
4、为实现上述目的，本专利技术所采取的主要技术方案包括：</p>5、本专利技术的一方面提供了从苦荞麦中分离得到的磷酸激酶基因ftpak，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：
6、(a)、seq id no.1所示的多核苷酸序列；或
7、(b)、编码seq id no.2所示氨基酸序列的多核苷酸序列；或
8、(c)、与seq id no.1的多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列所编码蛋白质仍具有催化黄酮类物质合成的功能或活性；或
9、(d)、与seq id no.1所示的多核苷酸序列至少有90％或以上同源性的多核苷酸序列；或
10、(e)、在seq id no.1所示的多核苷酸序列的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有催化黄酮类物质合成的功能或活性。
11、本专利技术的另一方面提供了从苦荞分离得到的磷酸激酶基因ftpak的编码蛋白ftpak，其氨基酸序列为(a)或(b)所示：
12、(a)、seq id no.2所示的氨基酸；或
13、(b)、将seq id no.2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有催化黄酮类物质合成的功能或活性的蛋白变体。
14、本专利技术所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过dna的突变来制备磷酸激酶ftpak的氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。
15、本专利技术还提供了含有所述磷酸激酶基因ftpak的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。
16、将本专利技术的seq id no.1所示的基因与其他基因相嵌合或连接得到的嵌合基因或表达盒均属于本专利技术的保护范畴；含有所述的嵌合基因或表达盒的重组表达载体同样也属于本专利技术的保护范围之内。
17、将所述磷酸激酶基因ftpak可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区、seq id no.1所示的多核苷酸序列和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mrna切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。
18、另外，本领域技术人员可以将seq id no.1所示的多核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率；例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达效率。
19、本专利技术中所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。
20、本专利技术还涉及将所述的磷酸激酶基因ftpak引入到植物中以调控植物黄酮类化合物合成的应用，其中，所述的调控植物黄酮类化合物包括促进黄酮类化合物的生物合成；作为参考，所述的应用包括：(1)构建含有所述磷酸激酶基因ftpak的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将磷酸激酶基因ftpak在植物组织或细胞中进行过表达，促进植物中黄酮类化合物的生物合成。
21、本专利技术进一步提供了一种促进植物体内黄酮类化合物生物合成的方法，包括：(1)构建含有所述磷酸激酶基因ftpak的重组植物表达载体；(2)将所构建的磷酸激酶基因ftpak的重组表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将所述磷酸激酶基因ftpak在植物组织或细胞中进行过表达，促进植物中黄酮类化合物的生物合成。
22、本专利技术还提供了一种培育黄酮类化合物高表达的植物品种的方法，包括：(1)构建含有所述磷酸激酶基因ftpak或其嵌合基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将所述编码磷酸激酶基因ftpak在植物组织或细胞中进行过表达，筛选黄酮类化合物的表达或含量提高的植物品种。
23、本专利技术中所述的转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本专利技术ftpak磷酸激酶的编码基因提供给植物。在其它实施方案中，本专利技术的ftpak磷酸激酶的编码基因可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入到植物中，通常，这样的方法涉及将本专利技术的转录因子的编码基因构建体引入病毒dna或rna分子中。
24、利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(mccormick etal.plantcell reports.1986.5:81-84)。本专利技术可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物，优选的，所述的目标植物包括荞麦、大豆、白三叶、苜蓿或拟南芥等，优选本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.从苦荞麦中分离得到的磷酸激酶基因，其特征在于，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：
2.权利要求1所述的从苦荞分离得到的磷酸激酶基因FtPAK的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为(a)或(b)所示：
3.含有权利要求1所述磷酸激酶基因的表达盒或重组表达载体。
4.含有权利要求3所述的表达盒或重组表达载体的重组宿主细胞。
5.权利要求1所述的磷酸激酶基因、权利要求2所述的编码蛋白、权利要求3所述的表达盒或重组表达载体、权利要求4所述的重组宿主细胞在调控植物黄酮类化合物生物合成中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的调控植物黄酮类化合物生物合成是促进植物黄酮类化合物的生物合成。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：(1)构建含有所述磷酸激酶基因FtPAK的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将磷酸激酶基因FtPAK在植物组织或细胞中进行过表达，促进植物中黄酮类化合物的生物合成。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的黄酮类物质包括山奈酚-3-O-葡萄糖苷，异斛皮苷或杨梅素-3-O-葡萄糖苷；
9.一种培育黄酮类化合物高表达的植物品种的方法，其特征在于，包括：(1)构建含有权利要求1所述磷酸激酶基因FtPAK或其嵌合基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将所述磷酸激酶基因FtPAK在植物组织或细胞中进行过表达，筛选黄酮类物质的表达或含量提高的植物品种。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的黄酮类化合物包括山奈酚-3-O-葡萄糖苷，异斛皮苷或杨梅素-3-O-葡萄糖苷；
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【技术特征摘要】
1.从苦荞麦中分离得到的磷酸激酶基因，其特征在于，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：
2.权利要求1所述的从苦荞分离得到的磷酸激酶基因ftpak的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为(a)或(b)所示：
3.含有权利要求1所述磷酸激酶基因的表达盒或重组表达载体。
4.含有权利要求3所述的表达盒或重组表达载体的重组宿主细胞。
5.权利要求1所述的磷酸激酶基因、权利要求2所述的编码蛋白、权利要求3所述的表达盒或重组表达载体、权利要求4所述的重组宿主细胞在调控植物黄酮类化合物生物合成中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的调控植物黄酮类化合物生物合成是促进植物黄酮类化合物的生物合成。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：(1)构建含有所述磷酸激酶基因ftp...
【专利技术属性】
技术研发人员：张凯旋，周美亮，黄旭，何毓琦，李伟，赖弟利，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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