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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物,更具体地,涉及基于甲基化测序的年龄检测方法。
技术介绍
1、
2、在衰老领域的研究中,小鼠作为与人类最接近的物种之一常被用来作为探究衰老机制的模式物种。在衰老机制研究中特别是对衰老过程进行干预的研究中,如何准确对小鼠的年龄进行检测非常重要。常见的小鼠年龄检测方法主要基于生理和行为,比如体重法,臼齿磨损度法,晶体干重法,体长法,头骨干重法,行为测试等。
3、现在常用的小鼠年龄检测方法都有比较明显的缺点,比如体重法由于体重易受鼠的胃容物、繁殖状况等因素的影响较大,各年龄组之间数值重叠多,年龄划分可能存在一定误差;体长法则由于体长易受测量者熟练程度及鼠体状态的影响造成人为误差;晶体干重法工作量大,要求严格,操作难度大;臼齿磨损度法受食物配比,臼齿生长等影响有一定局限性。近年也有基于分子标志物表达来测定小鼠年龄的方法,但在精确度上不高一般需结合生理特征来判断小鼠年龄。
4、综合现有的检测方法,在衰老研究中急需一种精确度高,易于操作的年龄检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于建立基于肺组织dna甲基化测序的年龄检测方法,适用于肺组织dna甲基化文库构建,二代测序及小鼠的年龄检测。
2、本申请涉及基于肺组织dna甲基化测序的年龄检测方法,具体步骤如下:
3、(a)从小鼠肺组织提取基因组dna;
4、(b)将基因组dna进行mspi酶切;
5、(c)将步骤(b)中的酶切产物补平,末
6、(d)将步骤(c)中的产物进行重亚硫酸盐转化;
7、(e)将步骤(d)中的产物进行扩增,回收目标dna片段,获得甲基化测序文库;
8、(f)将所述甲基化测序文库进行二代测序和数据分析;
9、(g)将数据分析的结果代入甲基化年龄检测模型公式中计算得到小鼠的年龄,其中,所述甲基化年龄检测模型公式的公式为:x为位点的甲基化程度,n为累加公式的终止数值535,代表共有535个甲基化位点,甲基化位点见附表1cpg位点及对应参数表格,i为累加过程中的当前项的索引,βi见图6cpg位点及对应参数表格。
10、在一些实施方式中,在步骤(a)中肺组织的量为1mg-15mg。
11、进一步的,在步骤(b)中基因组dna的量为100ng-1ug。
12、进一步的,在步骤(b)中mspi酶切的具体步骤为:每个样本取100ng基因组dna用10units mspi(r0106s,neb)37℃酶切16小时以上,采用mspi酶的原因是该内切酶对甲基化位点不敏感,酶切不受甲基化位点影响,其他的内切酶对甲基化位点敏感,遇到甲基化位点无法进行酶切。
13、在一些实施方式中,所述步骤(c)中接头的序列是含有5-甲基胞嘧啶的,序列为seq id no:1和seq id no:2,含有5-甲基胞嘧啶是为了确保在后续的重亚硫酸盐转化的时候碱基不产生变化,如果不做这个处理做后续的重亚硫酸盐转化时碱基发生改变会导致测序失败。
14、进一步的,在步骤(c)中接头需要进行预退火处理,将合成好的含有5-甲基胞嘧啶的p5(序列见seq id no:1)与p7(序列见seq id no:2)在95℃10min后以0.1℃/s的速度降温至15℃,15℃5min后降至4℃,通过预退火处理将含有5-甲基胞嘧啶的p5与p7进行退火合成illumina接头,其中,所述退火条件为10ul p5(100um)、10ul p7(100um)、3ul tris-hcl(10mm)ph 8.0、77ulddh2o,用illumina接头是为了匹配后续用illumina仪器测序,先加接头再做重亚硫酸盐的好处是对于起始用量要求低。
15、进一步的,将步骤(b)的酶切产物在50ul的反应体系中进行补平,所述50ul的反应体系包含10u的klenow片段酶(3'→5'外切,neb)、40um的dgtp、40um的5'甲基化dctp(roche)、400um的datp以及1×neb缓冲液2,所述补平步骤包括:将步骤(b)的酶切产物在50ul的反应体系中在30℃下孵育20分钟,然后在37℃下孵育20分钟,补平的dna片段与步骤(3)得到的illumina接头进行连接。
16、进一步的,50ul的反应体系中还包含2000u的t4连接酶(neb)、10ul腺苷酸化dna以及0.5到1.0um的接头,于16℃下连接16小时以上。
17、在一些实施方式中,在步骤(d)中,使用epitect bisulfite kit(qiagen)按其操作步骤对步骤(c)的产物进行重亚硫酸盐转化。
18、在一些实施方式中,将步骤(d)中的产物进行扩增的具体步骤为:取20ul步骤(d)得到得转化后的dna加入25ulkapa hifi hotstart readymix(2x)(roche),5ullibraryamplification primer mix(10x)(roche),混匀后进行pcr反应,执行16个循环后,72℃延伸1min,4℃保存;其中,所述pcr反应的条件为:98℃预变性45s,98℃变性15s,60℃退火30s,72℃延伸30s。
19、进一步的,在步骤(e)中,将获得的pcr产物进行回收目标dna片段的步骤为:将获得的pcr产物在6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳的电压为120v,电泳的时间为1h,随后,用万分之一gelred染液染色5分钟,然后置紫外灯下观察并拍照,割取180~260bp之间的条带并回收。
20、进一步的,在步骤(e)中,使用agilent 2100bioanalyzer对上述甲基化测序文库进行片段长度范围检测,得到制备完成的甲基化测序文库。
21、进一步的,在步骤(e)中回收目标dna片段为180-260bp。
22、与现有技术相比,本专利技术的有益效果在于:
23、(1)易于操作,本方法对年龄检测只需对小鼠肺组织dna进行甲基化测序,将测序结果通过公式计算即可得到小鼠的年龄。
24、(2)准确度高,本方法通过大量样本建立的甲基化年龄检测模型,经过大量样本的验证,通过计算得出的年龄与时间年龄相关性高达0.98(见图4)。
25、(3)受外界影响因素少,常规的年龄检测方法多基于生理形态的测定,受食物,生长环境,小鼠个体差异等影响,而本方法基于小鼠肺组织dna甲基化水平,在分子层面来确定小鼠的年龄,受外界影响因素少。
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1.一种基于肺部组织甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:
2.根据权利要求1所述的基于肺部组织甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:在步骤(b)中MspI酶切的具体步骤为:每个样本取100ng基因组DNA用10Units MspI(R0106S,NEB)37℃酶切16小时以上,采用MspI酶的原因是该内切酶对甲基化位点不敏感,酶切不受甲基化位点影响,其他的内切酶对甲基化位点敏感,遇到甲基化位点无法进行酶切。
3.根据权利要求1所述的基于肺部组织甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:所述步骤(c)中接头的序列是含有5-甲基胞嘧啶的,序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
4.根据权利要求1所述的基于肺组织DNA甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:在步骤(c)中接头需要进行预退火处理,将合成的含有5-甲基胞嘧啶的P5(序列见SEQID NO:1)和P7(序列见SEQ ID NO:2)在95℃10min后以0.1℃/s的速度降温至15℃,15℃5min后降至4℃,通过预退火处理将含有5-甲基胞嘧啶的P5与P7进行退
5.根据权利要求1所述的基于肺组织DNA甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:将步骤(b)的酶切产物在50ul的反应体系中进行补平,所述50ul的反应体系包含10U的Klenow片段酶(3'→5'外切,NEB)、40uM的dGTP、40uM的5'甲基化dCTP(Roche)、400uM的dATP以及1×NEB缓冲液2,所述补平步骤包括:将步骤(b)的酶切产物在50ul的反应体系中在30℃下孵育20分钟,然后在37℃下孵育20分钟,补平的DNA片段与步骤(3)得到的Illumina接头进行连接。
6.根据权利要求1所述的基于肺组织DNA甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:50ul的反应体系中还包含2000U的T4连接酶(NEB)、10ul腺苷酸化DNA以及0.5到1.0uM的接头,于16℃下连接16小时以上。
7.根据权利要求1所述的基于肺组织DNA甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:在步骤(d)中,使用EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen)按其操作步骤对步骤(c)的产物进行重亚硫酸盐转化。
8.根据权利要求1所述的基于肺组织DNA甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:将步骤(d)中的产物进行扩增的具体步骤为:取20ul步骤(d)得到得转化后的DNA加入25ulKAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)(Roche),5ulLibrary Amplification PrimerMix(10X)(Roche),混匀后进行PCR反应,执行16个循环后,72℃延伸1min,4℃保存;其中,所述PCR反应的条件为:98℃预变性45s,98℃变性15s,60℃退火30s,72℃延伸30s。
9.根据权利要求1所述的基于肺组织DNA甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:在步骤(e)中,将获得的PCR产物进行回收目标DNA片段的步骤为:将获得的PCR产物在6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳的电压为120V,电泳的时间为1h,随后,用万分之一Gelred染液染色5分钟,然后置紫外灯下观察并拍照,割取180~260bp之间的条带并回收。
10.一种用于小鼠年龄检测方法的标志物,所述标志物来源于小鼠肺组织DNA甲基化位点,其特征在于,所述甲基化位点包括chr1:3037825、chr1:10535220、chr1:20891209、chr1:21218783、chr1:23763085、chr1:33670409、chr1:34433272、chr1:38836234、chr1:39709849、chr1:43163929、chr1:44198824、chr1:54194597、chr1:56969767、chr1:59215759、chr1:61356277、chr1:75360447、chr1:77506886、chr1:77514598、chr1:78216726、chr1:78658223、chr1:86669744、chr1:88277358、chr1:89580406、chr1:89580537、chr1:89887334、chr1:91345264、chr1:93635690、chr1:93686442、chr1:105991574、chr1:10...
【技术特征摘要】
1.一种基于肺部组织甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:
2.根据权利要求1所述的基于肺部组织甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:在步骤(b)中mspi酶切的具体步骤为:每个样本取100ng基因组dna用10units mspi(r0106s,neb)37℃酶切16小时以上,采用mspi酶的原因是该内切酶对甲基化位点不敏感,酶切不受甲基化位点影响,其他的内切酶对甲基化位点敏感,遇到甲基化位点无法进行酶切。
3.根据权利要求1所述的基于肺部组织甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:所述步骤(c)中接头的序列是含有5-甲基胞嘧啶的,序列为seq id no:1和seq id no:2。
4.根据权利要求1所述的基于肺组织dna甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:在步骤(c)中接头需要进行预退火处理,将合成的含有5-甲基胞嘧啶的p5(序列见seqid no:1)和p7(序列见seq id no:2)在95℃10min后以0.1℃/s的速度降温至15℃,15℃5min后降至4℃,通过预退火处理将含有5-甲基胞嘧啶的p5与p7进行退火合成illumina接头,其中,所述退火条件为10ul p5(100um)、10ul p7(100um)、3ul tris-hcl(10mm)ph 8.0、77ulddh2o。
5.根据权利要求1所述的基于肺组织dna甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:将步骤(b)的酶切产物在50ul的反应体系中进行补平,所述50ul的反应体系包含10u的klenow片段酶(3'→5'外切,neb)、40um的dgtp、40um的5'甲基化dctp(roche)、400um的datp以及1×neb缓冲液2,所述补平步骤包括:将步骤(b)的酶切产物在50ul的反应体系中在30℃下孵育20分钟,然后在37℃下孵育20分钟,补平的dna片段与步骤(3)得到的illumina接头进行连接。
6.根据权利要求1所述的基于肺组织dna甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:50ul的反应体系中还包含2000u的t4连接酶(neb)、10ul腺苷酸化dna以及0.5到1.0um的接头,于16℃下连接16小时以上。
7.根据权利要求1所述的基于肺组织dna甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:在步骤(d)中,使用epitect bisulfite kit(qiagen)按其操作步骤对步骤(c)的产物进行重亚硫酸盐转化。
8.根据权利要求1所述的基于肺组织dna甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:将步骤(d)中的产物进行扩增的具体步骤为:取20ul步骤(d)得到得转化后的dna加入25ulkapa hifi hotstart readymix(2x)(roche),5ullibrary amplification primermix(10x)(roche),混匀后进行pcr反应,执行16个循环后,72℃延伸1min,4℃保存;其中,所述pcr反应的条件为:98℃预变性45s,98℃变性15s,60℃退火30s,72℃延伸30s。
9.根据权利要求1所述的基于肺组织dna甲基化测序的小鼠年龄检测方法,其特征在于:在步骤(e)中,将获得的pcr产物进行回收目标dna片段的步骤为:将获得的pcr产物在6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳的电压为120v,电泳的时间为1h,随后,用万分之一gelred染液染色5分钟,然后置紫外灯下观察并拍照,割取180~260bp之间的条带并回收。
10.一种用于小鼠年龄检测方法的标志物,所述标志物来源于小鼠肺组织dna甲基化位点,其特征在于,所述甲基化位点包括chr1:3037825、chr1:10535220、chr1:20891209、chr1:21218783、chr1:23763085、chr1:33670409、chr1:34433272、chr1:38836234、chr1:39709849、chr1:43163929、chr1:44198824、chr1:54194597、chr1:56969767、chr1:59215759、chr1:61356277、chr1:75360447、chr1:77506886、chr1:77514598、chr1:78216726、chr1:78658223、chr1:86669744、chr1:88277358、chr1:89580406、chr1:89580537、chr1:89887334、chr1:91345264、chr1:93635690、chr1:93686442、chr1:105991574、chr1:106171941、chr1:106173145、chr1:117733122、chr1:119048125、chr1:119048131、chr1:120602318、chr1:120603667、chr1:127749117、chr1:131245287、chr1:134290194、chr1:135105081、chr1:135105202、chr1:135430505、chr1:146391077、chr1:153332359、chr1:158936019、chr1:170215004、chr1:175492400、chr1:175492531、chr1:180794116、chr1:182731721、chr1:184727535、chr1:184732357、chr1:184735176、chr1:185095102、chr1:186582402、chr1:187609178、chr1:192092513、chr10:7872672、chr10:11878450、chr10:39370304、chr10:42644620、chr10:53539064、chr10:60106623、chr10:60687109、chr10:62792237、chr10:67548623、chr10:71159734、chr10:79637240、chr10:79637268、chr10:79759104、chr10:79985721、chr10:79997405、chr10:80347723、chr10:81176537、chr10:83004436、chr10:85658526、chr10:93301783、chr10:93641063、chr10:108446907、chr10:110745387、chr10:116428554、chr10:117628840、chr10:120553155、chr10:122448879、chr10:128589610、chr10:128805080、chr11:3863683、chr11:5837368、chr11:6223407、chr11:12037316、chr11:19020674、chr11:22003893、chr11:24080918、chr11:31671789、chr11:33012395、chr11:43836610、chr11:46291283、chr11:51606975、chr11:57802678、chr11:58640727、chr11:59290554、chr11:60479005、chr11:61069264、chr11:61408066、chr11:65270241、chr11:66526110、chr11:67922462、chr11:68349095、chr11:69135110、chr11:69326587、chr11:70432652、chr11:72489684、chr11:76672804、chr11:78826619、chr11:79146087、chr11:83429347、chr11:87405381、chr11:97476141、chr11:101964029、chr11:102291094、chr11:102948707、chr11:106008079、chr11:114066147、chr11:114217666、chr11:114650655、chr11:115604871、chr11:116334359、chr11:119042507、chr11:119044797、chr11:119254493、chr11:119546918、chr11:120046968、chr11:120437305、chr12:4233790、chr12:13105569、chr12:14151952、chr12:49383191、chr12:51593468、chr12:57197073、chr12:57576080、chr12:58787692、chr12:70111820、chr12:70680245、chr12:75176560、chr12:76822230、chr12:80132886、chr12:81971475、chr12:83688222、chr12:84572083、chr12:85816719、chr12:87387397、chr12:92507723、chr12:102362181、chr12:102743388、chr12:104474966、chr12:104476245、chr12:104963275、chr12:108334343、chr12:110447161、chr12:110738761、chr12:111274501、chr12:111567145、chr12:111998757、chr12:112144340、chr12:118843141、chr13:3359567、chr13:15463800、chr13:17943820、chr13:21180545、chr13:24280449、chr13:31615298、chr13:33578910、chr13:34130442、chr13:38037131、chr13:38580296、chr13:40738558、chr13:46727594、chr13:49947568、chr13:54766363、chr13:55452332、chr13:63565733、chr13:71960027、chr13:72631331、chr13:73637302、chr13:73637385、chr13:76597468、chr13:91807395、chr13:94702715、chr13:96131131、chr13:96131152、chr13:96132219、chr13:97072193、chr13:98316721、chr13:98354517、chr13:99592823、chr13:100650881、chr13:107870702、chr13:109116675、chr13:113293312、chr14:8098422、chr14:12822603、chr14:12822744、chr14:19235967、chr14:21990782、chr14:24156841、chr14:31131175、chr14:34673644、chr14:46883657、chr14:54464397、chr14:56885733、chr14:56908003、chr14:570578...
【专利技术属性】
技术研发人员:高振宇,李华,刘松柏,陈亚春,陈越,
申请(专利权)人:苏州卫生职业技术学院,
类型:发明
国别省市:
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