【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别是涉及一种酶催化生产尿苷的方法及应用。
技术介绍
1、尿苷（尿嘧啶核苷）是一种天然核苷类化合物，其分子量为244.2。尿苷是一种白色针状结晶或粉末，没有气味，味稍微甜及微辛，可溶于水，微溶于稀醇，不溶于无水乙醇，水中的溶解度为50 g/l。尿苷的密度为1.674 g/cm3，熔点为165-170℃。尿苷的衍生物鸟苷酸是构成rna的四种核苷酸之一，具有重要的生理作用。尿苷参与细胞多糖合成，具有提高细胞耐缺氧能力，降低细胞毒性的药用价值。尿苷和肌苷等合用能够促进脑细胞的产能代谢，具有改善神经系统生理功能，提高睡眠质量的作用。尿苷作为一种神经保护剂，可以减缓脑补衰老，预防痴呆症等认知功能障碍。尿苷还可以增加多巴胺的产生和释放，使人心情愉悦，可以用来治疗抑郁症。尿苷可以作为临床药物，还可以用于治疗肝、心脑血管等疾病。
2、目前，尿苷的生产方法主要包括rna水解法、化学合成法、微生物发酵法。rna水解法是历史上曾经采用的尿苷生产方法，但由于生产成本、环境污染、收率等原因，已经不使用了。化学合成法已有多种合成工艺，被用于尿苷的工业化生产。但是由于化学合成法生产尿苷存在环境污染大、副产物多、工业复杂等缺点，化学合成法生产尿苷基本被停用。已有关于采用微生物生产尿苷的报道，主要集中在采用枯草芽孢杆菌，进行诱变育种和基因工程改造等方式提高尿苷的产量。日本研究者tsunemi y等对枯草芽孢杆菌进行诱变育种等，筛选出了高产尿苷的菌株no. 556，其产量最高可到55 g/l（united states: 48807
3、因此，为了实现尿苷的高效生产，提供一种底物转化率高、无副产物、催化时间短、工艺简单的酶催化生产尿苷的方法是至关重要的。
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种酶催化生产尿苷的方法及应用，采用大肠杆菌高效表达胞苷脱氨酶 cdd，利用酶催化手段，以廉价的胞苷为原料，实现尿苷的高效生产；此外，本专利技术还将提供胞苷脱氨酶 cdd的突变体，以进一步提高酶转化底物的效率，缩短催化时间。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术的第一方面，提供一种胞苷脱氨酶 cdd在催化胞苷生产尿苷中的应用，所述胞苷脱氨酶 cdd的氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、于本专利技术的一实施例中，编码所述胞苷脱氨酶 cdd的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、本专利技术的第二方面，提供一种胞苷脱氨酶突变体在催化胞苷生产尿苷中的应用，所述胞苷脱氨酶突变体是上述胞苷脱氨酶 cdd的突变体，对胞苷脱氨酶c端的6个氨基酸残基组成的短肽289drvlla294进行截断，分别截断293la294、291vlla294、289drvlla294，构建获得胞苷脱氨酶突变体 cdd-m1、 cdd-m2、 cdd-m3。胞苷脱氨酶突变体能够进一步提高酶转化底物的效率，缩短催化时间。
6、其中，所述 cdd-m1的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述 cdd-m2的氨基酸序列如seq id no.5所示，所述 cdd-m3的氨基酸序列如seq id no.7所示。
7、于本专利技术的一实施例中，编码所述 cdd-m1的核苷酸序列如seq id no.4所示，编码所述 cdd-m2的核苷酸序列如seq id no.6所示，编码所述 cdd-m3的核苷酸序列如seq idno.8所示。
8、本专利技术的第三方面，提供一种酶催化生产尿苷的方法，所述方法为：将氨基酸序列如seq id no.1所示的胞苷脱氨酶 cdd，或表达氨基酸序列如seq id no.1所示的胞苷脱氨酶 cdd的重组菌，或氨基酸序列如seq id no.3、seq id no.5或seq id no.7所示的胞苷脱氨酶突变体，或表达氨基酸序列如seq id no.3、seq id no.5或seq id no.7所示的胞苷脱氨酶突变体的重组菌，添加至含有底物胞苷、磷酸钠缓冲液的反应体系中进行反应，制备得到尿苷。
9、于本专利技术的一实施例中，编码所述胞苷脱氨酶 cdd的核苷酸序列如seq id no.2所示；编码所述胞苷脱氨酶突变体的核苷酸序列如seq id no.4、seq id no.6或seq id no.8所示。
10、于本专利技术的一实施例中，所述胞苷脱氨酶 cdd的制备方法为：
11、（1）设计引物 cdd-fw和 cdd-rs，pcr扩增核苷酸序列如seq id no .2所示的胞苷脱氨酶 cdd基因，将胞苷脱氨酶 cdd基因采用酶切位点nco i和ecor i连接在质粒prsfduet-1上，获得重组质粒prsfduet-1- cdd；
12、（2）将重组质粒prsfduet-1- cdd转化入宿主菌中，制备得到重组菌；
13、（3）将重组菌进行诱导发酵，匀质破碎离心，得到胞苷脱氨酶 cdd。
14、于本专利技术的一实施例中，所述胞苷脱氨酶突变体的制备本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种胞苷脱氨酶cdd在催化胞苷生产尿苷中的应用，其特征在于，所述胞苷脱氨酶cdd的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述胞苷脱氨酶cdd的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种胞苷脱氨酶突变体在催化胞苷生产尿苷中的应用，其特征在于，所述胞苷脱氨酶突变体包括cdd-M1、cdd-M2、cdd-M3，所述cdd-M1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述cdd-M2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述cdd-M3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，编码所述cdd-M1的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，编码所述cdd-M2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码所述cdd-M3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.一种酶催化生产尿苷的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的胞苷脱氨酶cdd，或表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的胞苷脱氨酶cdd的重组菌，
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述胞苷脱氨酶cdd的制备方法为：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述胞苷脱氨酶突变体的制备方法为：
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，磷酸钠缓冲液的浓度为0.1 M，磷酸钠缓冲液的pH=7.0。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，胞苷脱氨酶cdd或胞苷脱氨酶突变体的添加量为1%~8w/w%。
10.核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的胞苷脱氨酶cdd基因，或含有核苷酸序列如SEQID NO.2所示的胞苷脱氨酶cdd基因的重组质粒，或含有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的胞苷脱氨酶cdd基因的重组菌，或核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示的胞苷脱氨酶突变体基因，或含有核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.8所示的胞苷脱氨酶突变体基因的重组质粒，或含有核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.8所示的胞苷脱氨酶突变体基因的重组菌，在催化生产尿苷或含有尿苷的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种胞苷脱氨酶cdd在催化胞苷生产尿苷中的应用，其特征在于，所述胞苷脱氨酶cdd的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述胞苷脱氨酶cdd的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.一种胞苷脱氨酶突变体在催化胞苷生产尿苷中的应用，其特征在于，所述胞苷脱氨酶突变体包括cdd-m1、cdd-m2、cdd-m3，所述cdd-m1的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述cdd-m2的氨基酸序列如seq id no.5所示，所述cdd-m3的氨基酸序列如seq id no.7所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，编码所述cdd-m1的核苷酸序列如seq idno.4所示，编码所述cdd-m2的核苷酸序列如seq id no.6所示，编码所述cdd-m3的核苷酸序列如seq id no.8所示。
5.一种酶催化生产尿苷的方法，其特征在于，将氨基酸序列如seq id no.1所示的胞苷脱氨酶cdd，或表达氨基酸序列如seq id no.1所示的胞苷脱氨酶cdd的重组菌，或氨基酸序列如seq id no.3、seq id no.5或seq id no.7所示的胞苷脱氨酶突变体，或表达氨基酸序列如seq id no.3、seq id no.5或...
【专利技术属性】
技术研发人员：于广，陈礼伟，陈嘉慧，陈小红，徐忠智，王沈军，
申请(专利权)人：江苏香地化学有限公司，
类型：发明
国别省市：
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