【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病原生物检测，更具体地，涉及高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的引物组、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、牛乳房炎（bovine mastitis， bm）、牛呼吸道疾病（(bovine respiratorydisease，brd）和牛消化道疾病（bovine diarrhea disease，bed）是反刍动物与肉牛养殖中的重要疾病。引起反刍动物乳房炎的病原微生物种类繁多，有细菌、真菌、支原体、病毒等，目前已报道的反刍动物乳房炎病原菌超过150种，往往是由优势菌群与几种病原微生物共同存在，而不是由单一的某一种病原引起。细菌性病原是导致牛呼吸道疾病发作的主要原因之一，且常以多种致病菌混合感染并继发其他病原感染的情况多见。病毒性病原也是导致呼吸道疾病发生的重要因素之一，常见的病毒性病原包括副流感3型病毒（bpiv3）、牛病毒性腹泻病毒（bvdv）等。牛消化道疾病经常表现为细菌、病毒、寄生虫等多种病原的混合感染，常见的病原有大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒等。
2、目前检测病原的方法主要有细菌分离鉴定法、血清学检测法、基因芯片、pcr检测技术和基因测序技术等。基于被检测的基因组区域，基因测序技术涉及三种基本的测序类型：宏基因组测序（metagenome sequencing，mngs）、全外显子测序（whole exomesequencing，wes）和靶向测序（targeted next generation sequencing，tngs）。现有的针对反刍动物病原体的检测方法，具
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供了高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的引物组、试剂盒及其应用。
2、根据本专利技术的一个方面，提供了高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的引物组，该引物组由核苷酸序列如seq id no：102~381所示的140对引物组成，每对引物由上游引物、下游引物组成，140对引物用于扩增病原靶标基因及耐药基因。
3、在一些实施方式中，140对引物分别针对反刍动物的83种病原靶标基因及18种耐药基因，每种病原靶标基因或耐药基因设有1~2对引物，83种病原靶标基因及18种耐药基因的序列如seq id no：1~101所示。
4、在一些实施方式中，每对引物中的双号序列为上游引物，每对引物中的单号序列为下游引物，上游引物和下游引物均带有接头序列。
5、在一些实施方式中，上游引物的接头序列为atcacgac，下游引物的接头序列为tgaacctt。
6、根据本专利技术的另一个方面，提供了上述高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的引物组在非疾病诊断目的地检测或辅助检测反刍动物的83种病原靶标基因及18种耐药基因的应用。
7、根据本专利技术的再一个方面，提供了高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的试剂盒，该试剂盒包括上述高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的引物组。
8、在一些实施方式中，该试剂盒还包括样品总dna/rna提取试剂、反转录试剂、pcr扩增试剂。
9、根据本专利技术的第四个方面，提供了上述高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的试剂盒在检测反刍动物的83种病原靶标基因及18种耐药基因的应用，反刍动物为牛。
10、根据本专利技术的第五个方面，提供了一种高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的方法，该方法采用上述高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的试剂盒，该方法为非疾病诊断目的方法，包括以下步骤：
11、s1.对待测样本进行总dna/rna核酸共提取；
12、s2.反转录；
13、s3.使用上述高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的试剂盒依次进行多重靶向pcr扩增，加接头扩增，得到测序文库；
14、s4.测序文库质检后上机进行高通量测序，获得测序数据，然后对测序数据进行分析，获得病原靶标基因及耐药基因检出结果。
15、在一些实施方式中，步骤s1提取的dna/rna浓度≥0.1ng/ul。
16、本专利技术的有益效果：本专利技术的引物组、试剂盒及检测方法针对反刍动物的83种病原靶标基因以及18种耐药基因的特定区域进行测序，提高了检测的准确性和特异性，能在一次实验中检测多种相关病原，能够检测到微量的病原核酸，有助于早期诊断；在短时间内可完成大量样本的检测，提高检测效率，相比全基因组测序，靶向测序成本更低；由于只针对特定区域，数据分析的复杂度降低，适用于各种临床样本，如血液、组织、分泌物等，为不同类型的样本检测提供了统一有效的方法。
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1.高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的引物组，其特征在于，所述引物组由核苷酸序列如SEQ ID NO：102~381所示的140对引物组成，每对所述引物由上游引物、下游引物组成，所述140对引物用于扩增病原靶标基因及耐药基因。
2.根据权利要求1所述的高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的引物组，其特征在于，所述140对引物分别针对反刍动物的83种病原靶标基因及18种耐药基因，每种病原靶标基因或耐药基因设有1~2对引物对，所述83种病原靶标基因及所述18种耐药基因的序列如SEQ ID NO：1~101所示。
3.根据权利要求1所述的高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的引物组，其特征在于，每对所述引物中的双号序列为上游引物，每对所述引物中的单号序列为下游引物，所述上游引物和所述下游引物均带有接头序列。
4.根据权利要求3所述的高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的引物组，其特征在于，所述上游引物的接头序列为ATCACGAC，所述下游引物的接头序列为TGAACCTT。
5.权利要求1-4任一项所述的高通量靶向检测反刍动物病
6.高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的引物组。
7.根据权利要求6所述的高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品总DNA/RNA提取试剂、反转录试剂、PCR扩增试剂。
8.权利要求6-7任一项所述的高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的试剂盒在检测反刍动物的83种病原靶标基因及18种耐药基因的应用，所述反刍动物为牛。
9.一种高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求6-7任一项所述的高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的试剂盒，所述方法为非疾病诊断目的方法，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的一种高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的方法，其特征在于，所述步骤S1提取的DNA/RNA浓度≥0.1ng/uL。
...【技术特征摘要】
1.高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的引物组，其特征在于，所述引物组由核苷酸序列如seq id no：102~381所示的140对引物组成，每对所述引物由上游引物、下游引物组成，所述140对引物用于扩增病原靶标基因及耐药基因。
2.根据权利要求1所述的高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的引物组，其特征在于，所述140对引物分别针对反刍动物的83种病原靶标基因及18种耐药基因，每种病原靶标基因或耐药基因设有1~2对引物对，所述83种病原靶标基因及所述18种耐药基因的序列如seq id no：1~101所示。
3.根据权利要求1所述的高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的引物组，其特征在于，每对所述引物中的双号序列为上游引物，每对所述引物中的单号序列为下游引物，所述上游引物和所述下游引物均带有接头序列。
4.根据权利要求3所述的高通量靶向检测反刍动物病原体及耐药基因的引物组，其特征在于，所述上游引物的接头序列为atcacgac，所述下游引物的接头序列为tgaacctt。
5.权利要求1-4任一项所述的高通量靶向检测反...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄金虎，田思瑾，胡贺，刘金鑫，王晓明，王丽平，
申请(专利权)人：南京农业大学三亚研究院，
类型：发明
国别省市：
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