【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及一种检测重组铜绿假单胞菌疫苗rpo抗原含量的方法。
技术介绍
1、铜绿假单胞菌是毒性最强的机会性革兰氏阴性细菌病原体之一，它会导致许多急性和慢性感染，包括肺炎和涉及尿路、伤口、烧伤和血液的感染，特别是在重症监护患者护理中，其感染与高发病率和死亡率相关。2017年who发布了一份优先研发新抗生素的病原体清单，铜绿假单胞菌被列为“最危急”等级，它的出现和传播已成为严重的公共卫生问题。有数据表明在一些欧洲、美国等区域，多重耐药和广泛耐药的铜绿假单胞菌占比在15％～30％，2022年11月柳叶刀杂志上报道了2019年死于铜绿假单胞菌感染的人数高达55.9万。pa感染及其耐药性已经成为一个棘手的医学难题。
2、疫苗是预防和控制铜绿假单胞菌感染的重要手段。在过去的50年里，科学家们一直在寻找一种有效的铜绿假单胞菌疫苗，研究了多种抗原和策略，许多保护性抗原被测试，如pcrv，oprf，opri，flge等，但开发有效的铜绿假单胞菌疫苗困难重重，阻碍因素有很多，如pa发病机制的复杂性、毒力因子的多样性、其在肺内的高度黏附性以及血清型的高度多样性等，这些都是需要面临的问题，因此目前没有获得批准上市的pa疫苗。迄今为止，已有60余种候选pa疫苗进行了动物实验或临床人体试验。
3、铜绿假单胞菌利用自身复杂的iii型分泌装置，它是一种针管状结构的蛋白复合物，可将效应蛋白注射到宿主细胞中，进而造成感染。铜绿假单胞菌v抗原(也称为pcrv蛋白)作为iii型分泌装置中针孔结构，为感染宿主过程从形成孔径通
4、脂蛋白i(opri)在不同血清型的pa菌株中具有保守性和高免疫原性，也是pa中研究最广泛的外膜蛋白。有研究表明opri具有佐剂效应，这是因为opri脂质尾通过与抗原提呈细胞(apcs)的toll样受体结合，从而刺激apcs活化促进il-12的产生，固有免疫因此启动，并且还诱导了特异性t细胞应答。opri也成了多种疫苗候选抗原。
5、在重组蛋白疫苗的研发中，蛋白抗原与佐剂吸附后的疫苗成品中的抗原含量作为稳定性检测指标之一，在疫苗生产过程中，测量抗原解吸附后的浓度可以判断疫苗中有效抗原成分的含量是否符合标准，这是保证疫苗质量稳定和可靠的关键环节，有助于避免因抗原含量不足或过高而影响疫苗的效力和安全性。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种检测重组铜绿假单胞菌疫苗rpo抗原含量的方法，可以快速准确的定量铜绿假单胞菌疫苗中rpo蛋白含量。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术提供的一种检测重组铜绿假单胞菌疫苗rpo抗原含量的方法，包括以下步骤：
4、(1)以opri-b052为捕获抗体包被酶标板；
5、(2)将被测样品加入包被后的酶标板中；
6、(3)酶标抗体pcrv-a039稀释后进行显色反应，测定od450/630nm值；
7、(4)利用rpo参比品制备标准曲线，根据标准曲线计算被测样品中rpo抗原含量。
8、进一步的，所述(1)中捕获抗体opri-b052以6μg/ml浓度进行4℃过夜包被，pbst洗四次，3％ bsa封闭，37℃孵育1小时，pbst洗四次。
9、进一步的，所述(2)中被测样品加入酶标板后需37℃孵育60min。
10、进一步的，所述(3)中酶标抗体pcrv-a039稀释1000、2000、3000、4000、5000、6000倍，37℃孵育1小时，洗涤后37℃显色10分钟，加入50μl 2m硫酸终止反应。
11、进一步的，所述(4)中标准曲线以抗原浓度的对数为横坐标，以od值的对数为纵坐标构建的曲线。
12、进一步的，所述(4)中标准曲线参比品浓度在78.125-2500ng/ml时，r2＝0.9938。
13、进一步的，所述opri-b052包括重链和轻链，所述重链和轻链分别包含三个cdr，其中重链cdr1 gftlssys，重链cdr2 isstssyi，重链cdr3 vrgvdfdy；轻链cdr1qsllhrngqky，轻链cdr2 lg，轻链cdr3 mqalqrpvt。
14、进一步的，所述pcrv-a039包括重链和轻链，所述重链和轻链分别包含三个cdr，其中重链cdr1 gdtlnnfa，重链cdr2 iipllgia，重链cdr3 atspvrgidygmdv；轻链cdr1qsvstd，轻链cdr2 da，轻链cdr3 qqrttwppmyt。
15、进一步的，所述pbst为na2hpo4 8mm、nacl 0.136m、kh2po4 2mm、kcl 2.6mm、tween-20 0.05％v/v。
16、基于上述技术方案，本专利技术实施例至少可以产生如下技术效果：
17、将opri-b052作为包被抗体，配对pcrv-a039作为检测抗体。可以快速准确的定量铜绿假单胞菌疫苗中rpo蛋白含量，且具有良好的稳定性和重复性。准确的抗原浓度测定结果是疫苗安全性和有效性的重要证据，有助于增强公众对疫苗的信任度和接种意愿，对于公共卫生防疫工作具有重要意义。
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1.一种检测重组铜绿假单胞菌疫苗rPO抗原含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测重组铜绿假单胞菌疫苗rPO抗原含量的方法，其特征在于，所述（1）中捕获抗体OprI-B052以6 μg/mL浓度进行4℃过夜包被，PBST洗四次，3% BSA封闭，37℃孵育1小时，PBST洗四次。
3.根据权利要求1所述的检测重组铜绿假单胞菌疫苗rPO抗原含量的方法，其特征在于，所述（2）中被测样品加入酶标板后需37℃孵育60 min。
4.根据权利要求1所述的检测重组铜绿假单胞菌疫苗rPO抗原含量的方法，其特征在于，所述（3）中酶标抗体PcrV-A039稀释1000、2000、3000、4000、5000、6000倍，37℃孵育1小时，洗涤后37℃显色10分钟，加入50 μL 2M硫酸终止反应。
5.根据权利要求1所述的检测重组铜绿假单胞菌疫苗rPO抗原含量的方法，其特征在于，所述（4）中标准曲线以抗原浓度的对数为横坐标，以OD值的对数为纵坐标构建的曲线。
6.根据权利要求1所述的检测重组铜绿假单胞菌疫苗rP
7.根据权利要求1所述的检测重组铜绿假单胞菌疫苗rPO抗原含量的方法，其特征在于，所述OprI-B052包括重链和轻链，所述重链和轻链分别包含三个CDR，其中重链CDR1GFTLSSYS，重链CDR2 ISSTSSYI，重链CDR3 VRGVDFDY；轻链CDR1 QSLLHRNGQKY，轻链CDR2LG，轻链CDR3 MQALQRPVT。
8.根据权利要求1所述的检测重组铜绿假单胞菌疫苗rPO抗原含量的方法，其特征在于，所述PcrV-A039包括重链和轻链，所述重链和轻链分别包含三个CDR，其中重链CDR1GDTLNNFA，重链CDR2 IIPLLGIA，重链CDR3 ATSPVRGIDYGMDV；轻链CDR1 QSVSTD，轻链CDR2DA，轻链CDR3 QQRTTWPPMYT。
9.根据权利要求1所述的检测重组铜绿假单胞菌疫苗rPO抗原含量的方法，其特征在于，所述PBST为Na2HPO4 8 mM、NaCl 0.136M、KH2PO4 2mM、KCl 2.6 mM、Tween-20 0.05%v /v。
...【技术特征摘要】
1.一种检测重组铜绿假单胞菌疫苗rpo抗原含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测重组铜绿假单胞菌疫苗rpo抗原含量的方法，其特征在于，所述（1）中捕获抗体opri-b052以6 μg/ml浓度进行4℃过夜包被，pbst洗四次，3% bsa封闭，37℃孵育1小时，pbst洗四次。
3.根据权利要求1所述的检测重组铜绿假单胞菌疫苗rpo抗原含量的方法，其特征在于，所述（2）中被测样品加入酶标板后需37℃孵育60 min。
4.根据权利要求1所述的检测重组铜绿假单胞菌疫苗rpo抗原含量的方法，其特征在于，所述（3）中酶标抗体pcrv-a039稀释1000、2000、3000、4000、5000、6000倍，37℃孵育1小时，洗涤后37℃显色10分钟，加入50 μl 2m硫酸终止反应。
5.根据权利要求1所述的检测重组铜绿假单胞菌疫苗rpo抗原含量的方法，其特征在于，所述（4）中标准曲线以抗原浓度的对数为横坐标，以od值的对数为纵坐标构建的曲线。
6.根据权利要求1所述的检测重组铜绿假单胞菌疫苗rpo抗原含量的方法，其特征在于，所述（4）中标...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖斐斐，杨举豪，蔡昌芝，黄诚，熊德林，刘杨，姜龙，杨峰，
申请(专利权)人：重庆原伦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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