摩尔根氏变形杆菌ＣＭＣＣ（Ｂ）４９２０８的（Ｄ）－专一性羰基还原酶的基因序列和氨基酸组成，属于生物工程技术领域。本发明专利技术确定摩尔根氏变形杆菌（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）ＣＭＣＣ（Ｂ）４９２０８的（Ｄ）－专一羰基还原酶，其基因核苷酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１，其氨基酸组成为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２，该（Ｄ）－专一性羰基还原酶基因用于生物法拆分外消旋化合物，利用该基因可使其重组菌用于外消旋手性拆分，并为进一步研究用于手性拆分的微生物立体选择性氧化还原酶的多样性，转化途径及反应机理创造条件。
【技术实现步骤摘要】
摩尔根氏变形杆菌(Morga"e//a;wo^z""') CMCC(B) 49208的(D)-羰基还原 酶的基因序列和氨基酸组成，该(D)-专一性羰基还原酶基因用于生物法拆分外消 旋化合物，属于生物工程
技术介绍
光学纯^伪麻黄碱，在医药上是多功能多用途的药物。在临床上主要用于 支气管哮喘，过敏型反应，低血压及鼻粘膜充血肿胀引起的鼻塞等治疗。由于 麻黄碱分子中含有复合官能团，因此还常被用于有机合成，研制新型药物。因 此，幵展麻黄碱拆分方法的研究极有意义。利用生物法转化制备光学纯的手性化合物具有反应条件温和，产物单一， 立体选择性、区域选择性和化学选择性较高，并能完成一些化学合成难以进行 的反应等优点。合成光学活性物质转化反应大致可分为两类 一类是把外消旋 体拆分为两个具有光学活性的对映体；另一类是从外消旋或手性的前体出发， 通过催化反应得到不对称的光学活性产物。90年代起国际上对微生物及酶拆分手性化合物进行大量的研究。酶由氨基酸 构成，其活性中心构成了一个不对称环境，有利于对消旋体的识别，是一种高 度手性的催化剂。其催化效率高，有较强的专一性。酶促拆分消旋体是比较理 想的选择。利用完整细胞对外消旋化合物进行转，可以获得光学纯对映体，在 非水相及有机 一 水双相反应体系中，也可酶促转化制备光学纯化合物。目前，部分立体选择性氧化还原酶基因已通过基因工程手段获得，而对于 来源于Morga"e//a morgam7 CMCC(B) 49208的立体选择性氧化还原酶基因，国 内外研究很少，其基因组序列等信息几乎为空白。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供Morga"e//a worgam7 CMCC(B) 49208的(D)-羰基还原酶 的基因序列和氨基酸组成，以便利用该基因的重组菌株进行外消旋手性拆分， 并为进一步研究用于手性拆分的微生物立体选择性氧化还原酶的多样性，转化 途径及反应机理创造条件。本专利技术的技术方案摩尔根氏变形杆菌(Morga"e//a Anorgam7) CMCC(B) 49208的(D)-专一性羰基还原酶，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。该摩尔 根氏变形杆菌(Morga"e〃a mc^a"") CMCC(B) 49208的(D)-专一性羰基还原酶，其氨基酸组成为SEQIDNO: 2。通过对立体选择性氧化还原酶酶学性质进行研究，认为来源于Morg朋e/fo wwg"w7 CMCC 490868的(D)-羰基还原酶将底物l-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK) 转化为A伪麻黄碱的反应机理为在NAD+的存在下，添加葡萄糖，葡萄糖脱 氢酶，使NAD+还原为NADH，然后在NADH的存在下，将底物l-苯基-2-甲氨 基丙酮(MAK)不对称还原为A伪麻黄碱。该酶催化氧化还原反应的最合适的初始pH为7.5，最合适的转化温度为30 °C。底物MAK浓度、葡萄糖的添加量和葡萄糖脱氢酶的浓度分别为150mg/L、 100|amol/L、 15U/mL。本专利技术所采用的微生物为摩尔根氏变形杆菌(ikforga"e//a mowam7)，保藏 于中国医学细菌保藏管理中心，保藏号CMCC(B) NO. 49208。本专利技术的有益效果本专利技术用转化效果较好的菌株worgam7 CMCC(B) 49208，分离获得(D)-羰基还原酶进行不对称转化底物l-苯基-2-甲氨 基丙酮(MAK)得到单一产物A伪麻黄碱。经转化液组成和转化条件优化后，所用酶蛋白不对称转化底物l-苯基-2-甲 氨基丙酮(MAK)，产物的产量有较大的提高，确定了优化的转化液组成和转化 条件。获得Mwga"e〃a wo"a"" CMCC(B) 49208的(D)-专一性羰基还原酶的基因， 并利用表达该基因的重组大肠杆菌进行外消旋手性拆分，为进一步研究用于手 性拆分的微生物立体选择性还原酶的多样性、转化途径及反应机理创造条件。 附图说明图1 CMCC(B) 49208的(D)-羰基还原酶的肽指纹图谱。 具体实施例方式Aforg朋e〃a mwga刚7 CMCC(B) 49208的(D)-专一性羰基还原酶基因的PCR 产物经试剂盒纯化后，利用BigDye测序试剂盒和应用生物系统自动DNA测序 仪进行核苷酸序列的测序，其核苷酸序列为SEQIDNO: 1，该还原酶氨基酸组 成为SEQIDNO: 2。实施例1:通过常规蛋白质分离纯化方法，获得M mwgam7 CMCC(B) 49208 的(D)-专一性羰基还原酶。取一定量酶液加入0.2 mol/LpH 7.5的磷酸缓冲液，150 mg/LMAK， 100 pmol/L葡萄糖，10mol/LNADH， 15U/mL葡萄糖脱氢酶，双 蒸水补足至lmL，在30 。C下反应10 h， HPLC (Agilent 1100 serices色谱仪， ZORBAXSBC18柱，G1314A紫外检测器，柱温40 °C，检测波长220 nm， 进样量10 mL，流动相为甲醇:0.02 mol/L的磷酸二氢钾缓冲液:乙酸:三乙胺 =4:96:0.2:0.13 (v:v:v:v))。检测结果表明，反应液中89%以上的MAK被转化为 cZ-伪麻黄碱。利用MADLI-TOF-MS方法获得该羰基不对称还原酶的肽指纹图谱，如图1 所示。经NCBI利用MASCOT通过Protein Prospector蛋白数据库对目的蛋白进 行鉴定，通过MOWSE评分方法，未能得到100。％的匹配识别，初步显示为一 种新蛋白。通过MOWSE评分方法获得最主要的一个匹配，检索所得有意义匹配蛋白 为一芽孢杆菌中的亮氨酸脱氢酶，而M mo^tw//CMCC(B) 49208菌株也属于芽 孢杆菌属，且羰基不对称还原酶与亮氨酸脱氢酶都为氧化还原酶系，此匹配蛋 白与目的酶应该有一定的同源性。与Protein Prospector蛋白数据库的下列序列比对，只与黑体字所标的核苷酸 相同。1 MALEIFEYLE KYDYEQVVFC QDKESGLKAI IAIHDTTLGP ALGGT丽TY 51 DSEEMIEDA LRLAKGMTYK N嵐GLNLGG AKTVIIGDPR腿SEAMFRA 101 LGRYIQGLNG RYITAEDVGT TV匪DIIHE ETDFVTGISP SFGSSGNPSP 151 VTAYGVYRGM KAAAKEAFGT DNLEGKVIAV QGVGNVAYHL CKHLHAEGAK 201 LIVTDINKEA VQRAVEEFGA TAVEPNEIYG VECDIYAPCA LGATVNDETI 251 PQLKAKVIAG S應QLKEDR HGDII腦GI VYAPDYVINA GGVINVADEL 301 YGYNRERALK RVESIYDTIA KVIEISKRDG IATYVMDRL AEERIASL認 351 SRSTYL腦H DIISRR 实施例2:取上下两部分("IAIHDTTL"和"IATYVAAD")核苷酸序列设 计兼并引物上游引物Z 1为5 ，-ATHGCNATHCAYGAYACNAC-3 ，；下游引物Z1为5，-GCNGCNACRTANGTNGCDAT-3，对M mo^am7CMCC本文档来自技高网...
【技术保护点】
摩尔根氏变形杆菌（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）ＣＭＣＣ（Ｂ）４９２０８的（Ｄ）－专一性羰基还原酶，其基因核苷酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：石贵阳，张梁，丁重阳，张鹏华，卢燕，王正祥，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。