【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，特别是涉及一种通过基因编辑技术制备高维生素c番茄材料的方法。
技术介绍
1、维生素c，亦称为抗坏血酸(l-ascorbate acid，asa)，是一种六碳糖的衍生物，在植物中主要作为重要的水溶性抗氧化分子和辅酶因子发挥生物学功能，其结构与葡萄糖相似，几乎存在于所有生物的细胞中，包括植物、动物、真菌和原生动物，是有氧生命所必需的一种有机酸。在植物体内，维生素c的含量容易受到外部环境的影响，例如生长环境、光照条件以及土壤养分等。这种不可或缺的营养素不仅是存在于植物体内的一种重要抗氧化剂，还能够维护植物健康、促进植株生长发育。对于植物来说，维生素c的存在能够帮助其抵抗外界压力、保持植株的生机与活力，进而健康茁壮成长。在植物体内，有关维生素c的合成途径已经被解析出来，发现主要存在四条维生素c的合成途径，即d-man/l-gal途径、半乳糖醛酸途径、l-古洛糖途径以及肌醇途径。维生素c的合成是一种复杂而精细的过程，在这些合成途径中，d-man/l-gal途径被一致认为是植物中最重要的维生素c合成途径。该途径的正常运行确保了维生素c的稳定合成与供应，为植物生长、发育和健康提供保障。
2、crispr/cas9作为第三代基因编辑技术，最早是在细菌和古细菌中被发现的，是近年来分子育种领域的热点技术，为高维生素c含量番茄材料的快速创制提供了新思路。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种通过基因编辑技术制备高维生素c番茄材料的方法，以解决上述现有技术存在的
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种靶向番茄csn5b基因的sgrna，所述sgrna包括sgrna1和sgrna2；
4、所述sgrna1的序列为seq id no.8所示序列的第718-793位；所述sgrna2的序列为seq id no.8所示序列的第1290-1365位；
5、所述sgrna1的靶点序列如seq id no.2所示；所述sgrna2的靶点序列如seq idno.3所示。
6、本专利技术还提供一种敲除番茄csn5b基因的cripsr/cas9基因编辑载体，所述cripsr/cas9基因编辑载体上包含上述sgrna。
7、优选地，所述cripsr/cas9基因编辑载体的核苷酸序列由seq id no.8所示序列和seq id no.9所示序列相连得到。
8、本专利技术还提供上述sgrna或上述cripsr/cas9基因编辑载体在提高番茄维生素c含量或高维生素c番茄育种中的应用。
9、本专利技术还提供一种通过基因编辑技术制备高维生素c番茄材料的方法，包括如下步骤：
10、将上述cripsr/cas9基因编辑载体转化至农杆菌中，利用农杆菌转化法侵染番茄子叶，并进行纯合突变体植株筛选，得到所述高维生素c番茄材料。
11、优选地，所述纯合突变体植株筛选的方法为：提取待测植株的基因组dna，采用seqid no.12-13所示的引物组合对所述基因组dna进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；对所述pcr扩增产物进行测序，将测序结果与seq id no.1所示的野生型序列比对，根据比对结果筛选纯合突变体植株。
12、本专利技术还提供一种非转基因的高维生素c番茄植株的制备方法，将上述方法制备得到的高维生素c番茄自交，筛选csn5b基因突变且不携带外源dna片段的自交子代，为所述非转基因的高维生素c番茄植株。
13、优选地，所述csn5b基因突变且不携带外源dna片段的自交子代的筛选方法为：提取待测植株的基因组dna，采用seq id no.10-11所示的引物组合对所述基因组dna进行pcr扩增，没有pcr扩增产物的待测植株为csn5b基因突变且不携带外源dna片段的自交子代。
14、本专利技术还提供一种与番茄维生素c含量有关的csn5b突变体基因，所述csn5b突变体基因的核苷酸序列与野生型csn5b基因相比，第1075-1254位之间缺失了180bp；所述野生型csn5b基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
15、本专利技术还提供检测上述csn5b突变体基因的试剂在筛选高维生素c番茄品种中的应用。
16、本专利技术公开了以下技术效果：
17、在植物体内，vtc1(gdp-甘露糖焦磷酸化酶)是维生素c合成d-man/l-gal途径中的关键酶，而该酶的活性受到csn5b基因的负向调控。本专利技术根据番茄csn5b基因设计两个sgrna靶点，并由此设计得到靶向番茄csn5b基因的cripsr/cas9基因编辑载体，利用cripsr/cas9基因编辑技术敲除番茄csn5b基因的特定位置，使番茄果实在不改变表型的情况下，维生素c含量得到较大程度的提升。
18、通过实验证明：将cripsr/cas9基因编辑载体转化番茄材料可对其csn5b基因进行精确编辑，获得高维生素c番茄材料，并从其自交子代中可筛选得到csn5b基因纯合突变的非转基因高维生素c番茄材料。本专利技术的基因编辑方法适用于不同品种的番茄材料，且编辑效率高，可以快速将普通品种番茄材料转变为高维生素c番茄材料。该方法可以极大地缩短转育时间，且不受连锁累赘和转基因安全等因素的限制，具有极大的育种应用前景和经济价值。
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1.一种靶向番茄CSN5B基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2；
2.一种敲除番茄CSN5B基因的CRIPSR/Cas9基因编辑载体，其特征在于，所述CRIPSR/Cas9基因编辑载体上包含权利要求1所述的sgRNA。
3.根据权利要求2所述的CRIPSR/Cas9基因编辑载体，其特征在于，所述CRIPSR/Cas9基因编辑载体的核苷酸序列由SEQ ID NO.8所示序列和SEQ ID NO.9所示序列相连得到。
4.权利要求1所述的sgRNA或权利要求2或3所述的CRIPSR/Cas9基因编辑载体在提高番茄维生素C含量或高维生素C番茄育种中的应用。
5.一种通过基因编辑技术制备高维生素C番茄材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述纯合突变体植株筛选的方法为：提取待测植株的基因组DNA，采用SEQ ID NO.12-13所示的引物组合对所述基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行测序，将测序结果与SEQ I
7.一种非转基因的高维生素C番茄植株的制备方法，其特征在于，将权利要求5或6所述方法制备得到的高维生素C番茄自交，筛选CSN5B基因突变且不携带外源DNA片段的自交子代，为所述非转基因的高维生素C番茄植株。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述CSN5B基因突变且不携带外源DNA片段的自交子代的筛选方法为：提取待测植株的基因组DNA，采用SEQ ID NO.10-11所示的引物组合对所述基因组DNA进行PCR扩增，没有PCR扩增产物的待测植株为CSN5B基因突变且不携带外源DNA片段的自交子代。
9.一种与番茄维生素C含量有关的CSN5B突变体基因，其特征在于，所述CSN5B突变体基因的核苷酸序列与野生型CSN5B基因相比，第1075-1254位之间缺失了180bp；所述野生型CSN5B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
10.检测权利要求9所述的CSN5B突变体基因的试剂在筛选高维生素C番茄品种中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种靶向番茄csn5b基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna包括sgrna1和sgrna2；
2.一种敲除番茄csn5b基因的cripsr/cas9基因编辑载体，其特征在于，所述cripsr/cas9基因编辑载体上包含权利要求1所述的sgrna。
3.根据权利要求2所述的cripsr/cas9基因编辑载体，其特征在于，所述cripsr/cas9基因编辑载体的核苷酸序列由seq id no.8所示序列和seq id no.9所示序列相连得到。
4.权利要求1所述的sgrna或权利要求2或3所述的cripsr/cas9基因编辑载体在提高番茄维生素c含量或高维生素c番茄育种中的应用。
5.一种通过基因编辑技术制备高维生素c番茄材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述纯合突变体植株筛选的方法为：提取待测植株的基因组dna，采用seq id no.12-13所示的引物组合对所述基因组dna进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；对所述pcr扩增产物进行测序，将测序...
【专利技术属性】
技术研发人员：艾鹏飞，田文超，安煊森，王雁伟，卢利平，
申请(专利权)人：河北科技大学，
类型：发明
国别省市：
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