【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于均相免疫检测，尤其涉及一种蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法。
技术介绍
1、蓖麻毒素(rt)是从蓖麻种子中提取出来的一种具有高毒性的糖蛋白生物毒素。蓖麻毒素的分子量约为65kda，是由二硫键连接的a、b两条多肽链组成的糖蛋白异二聚体。蓖麻毒素由a链(rta)和b链(rtb)组成，rta是毒性链，具有糖苷酶活性；rtb具有凝结素活性，凭借其多肽链上的两个半乳糖结合位点与细胞上含半乳糖的糖蛋白或糖脂结合，将rta释放发挥毒性作用，是一种潜在的生物恐怖剂，目前尚无研究出有效解毒剂。因此，现场快速辨别诊断是否蓖麻毒素中毒至关重要。目前主要的检测方法有免疫标记分析法、生物质谱法和生物传感法等。常规方法存在一些不利于现场检测的缺陷，elisa作为常用免疫检测方法，其检测所用时间较长；质谱法灵敏度高，但质谱仪器价格昂贵，对操作人员的专业程度高，都不适合现场检测。
2、时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroim-munoassay,trfia)是一种非同位素荧光免疫分析，利用稀土离子更大的斯托克斯位移来避免溶液和材料的自发光影响。可有效排除非特异性荧光的干扰，提高灵敏度。荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer,fret)是新兴的分子光谱分析方法，是一种非辐射能量转移过程。由forster于1948年首先提出，因此又称为forster能量转移。利用的是荧光供体和荧光受体两种荧光基团间的能量转移，只有两者足够近时，才能产生能量转移，发出特定波长的发
3、均相时间分辨荧光(htrf，homogeneous time-resolvedfluorescence)技术是用来检测均相体系中待测物的一种常用方法，结合了荧光共振能量转移(fret)和时间分辨荧光(trf)两种技术。现有技术中通常采用镧系穴状化合物结合均相时间分辨荧光技术来检测蓖麻毒素，但是镧系穴状化合物的荧光强度不高并不利于荧光信号的收集，因此，急需提供一种新的均相时间分辨荧光检测方法来实现蓖麻毒素的定量检测。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，该方法操作简便、样品用量少且无需清洗、特异性高，极适用于现场检测。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，包括以下步骤：
4、1)将镧系荧光微球悬液、nhs和edc混合反应得到活化的镧系荧光微球悬液；将活化的镧系荧光微球悬液和抗蓖麻毒素多克隆抗体混合后加入bsa溶液封闭得到偶联液a；
5、2)将活化的别藻蓝蛋白和抗蓖麻毒素单克隆抗体反应后，加入dmso溶液封闭得到偶联液b；
6、3)将至少三种不同浓度蓖麻毒素标准溶液分别与偶联a和偶联液b混合进行反应，反应完毕后测量体系在665nm处的时间分辨荧光，以蓖麻毒素的浓度为横坐标，以该浓度对应的665nm处荧光强度为纵坐标，建立标准曲线；
7、将偶联液a、偶联液b和蓖麻毒素溶液混合、反应后，测量体系在665nm处的时间分辨荧光，根据所述蓖麻毒素溶液的荧光强度和标准曲线，计算得到所述蓖麻毒素溶液中蓖麻毒素的含量。
8、优选的，步骤1)所述镧系荧光微球悬液中镧系荧光微球的粒径为80～120nm；所述镧系荧光微球中镧系元素的包被量为0.2×10-6～2×10-6mol/ml。
9、优选的，步骤3)所述偶联液a的浓度为0.5～1μg/ml；所述偶联液b的浓度为10～20μg/ml。
10、优选的，步骤3)所述偶联液a、偶联液b和蓖麻毒素溶液的体积比为1:1～3:3～5。
11、优选的，步骤3)所述反应的时间为5～15min。
12、优选的，步骤1)所述镧系荧光微球悬液的浓度为5～15％；所述nhs的浓度为5～15mg/ml；所述edc的浓度为5～15mg/ml；所述镧系荧光微球悬液、nhs和edc的体积比为180～220:1:1。
13、优选的，步骤1)所述bsa溶液的终浓度为0.3～0.8％；所述活化的镧系荧光微球悬液、抗蓖麻毒素多克隆抗体和bsa溶液的质量比为1:80～120:40～60。
14、优选的，步骤2)所述活化的别藻蓝蛋白和抗蓖麻毒素单克隆抗体的质量比为1～3：1。
15、优选的，步骤2)所述dmso溶液的浓度为5～15mg/ml；所述抗蓖麻毒素单克隆抗体和dmso溶液的质量体积比为0.3～0.8mg:3～8μl。
16、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
17、本专利技术以镧系荧光微球为荧光供体，以别藻蓝蛋白荧光染料为荧光受体，通过优化镧系荧光微球的粒径、荧光微球中镧系元素的包被量、溶液浓度和反应时间等条件，建立了可以快速、特异、灵敏检测蓖麻毒素的均相免疫检测方法，检测下限可以达到38ng/ml。
18、本专利技术采用的均相免疫检测方法是将检测试剂和待测物放在同一介质中进行检测，反应和检测过程在同一介质中，且全过程免清洗，操作简便，反应均匀，只需将待测样品和检测所需试剂放在一起等待反应时间结束，便可以直接读取数值判断结果。
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1.一种蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，其特征在于，步骤1)所述镧系荧光微球悬液中镧系荧光微球的粒径为80～120nm；所述镧系荧光微球中镧系元素的包被量为0.2×10-6～2×10-6mol/mL。
3.根据权利要求1所述的蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，其特征在于，步骤3)所述偶联液A的浓度为0.5～1μg/mL；所述偶联液B的浓度为10～20μg/mL。
4.根据权利要求1所述的蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，其特征在于，步骤3)所述偶联液A、偶联液B和蓖麻毒素溶液的体积比为1:1～3:3～5。
5.根据权利要求1所述的蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，其特征在于，步骤3)所述反应的时间为5～15min。
6.根据权利要求1所述的蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，其特征在于，步骤1)所述镧系荧光微球悬液的浓度为5～15％；所述NHS的浓度为5～15mg/mL；所述EDC的浓度为5～15mg/mL；所述镧系荧光微球悬液、NHS和EDC的体
7.根据权利要求1所述的蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，其特征在于，步骤1)所述BSA溶液的终浓度为0.3～0.8％；所述活化的镧系荧光微球悬液、抗蓖麻毒素多克隆抗体和BSA溶液的质量比为1:80～120:40～60。
8.根据权利要求1所述的蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，其特征在于，步骤2)所述活化的别藻蓝蛋白和抗蓖麻毒素单克隆抗体的质量比为1～3：1。
9.根据权利要求1所述的蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，其特征在于，步骤2)所述DMSO溶液的浓度为5～15mg/mL；所述抗蓖麻毒素单克隆抗体和DMSO溶液的质量体积比为0.3～0.8mg:3～8μL。
...【技术特征摘要】
1.一种蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，其特征在于，步骤1)所述镧系荧光微球悬液中镧系荧光微球的粒径为80～120nm；所述镧系荧光微球中镧系元素的包被量为0.2×10-6～2×10-6mol/ml。
3.根据权利要求1所述的蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，其特征在于，步骤3)所述偶联液a的浓度为0.5～1μg/ml；所述偶联液b的浓度为10～20μg/ml。
4.根据权利要求1所述的蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，其特征在于，步骤3)所述偶联液a、偶联液b和蓖麻毒素溶液的体积比为1:1～3:3～5。
5.根据权利要求1所述的蓖麻毒素的均相免疫定量检测方法，其特征在于，步骤3)所述反应的时间为5～15min。
6.根据权利要求1所述的蓖麻毒素的均相免疫定量检测方...
【专利技术属性】
技术研发人员：高姗，王菁，曹亚坤，辛文文，康琳，李晓阳，王子鑫，张延松，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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