【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种肝前体细胞体外扩增的方法。
技术介绍
1、原位肝移植是终末期肝病患者和部分肝脏代谢缺陷患者的首选治疗方案。然而，肝移植存在创伤大、免疫排斥高发、术后门静脉高压和胆道并发症发生风险高及费用昂贵等问题，尤其是供体器官的短缺，使其临床应用受到很大的限制。近些年研究者们尝试利用肝细胞移植替代整肝移植，并已经在临床和动物模型中验证了其有效性。相比于传统的肝移植治疗，肝细胞移植有诸多优点：(1)治疗简单化。肝细胞移植可通过注射完成，易于操作，对受者的损害较小。(2)方便取用。肝细胞可以冷冻保存以备紧急情况使用。(3)可反复移植。为维持肝功能稳定，可进行多次细胞输注。(4)成本降低。细胞移植的成本相较于器官移植显著减少。(5)供体多样性。动物实验证明，从不适宜器官移植的病肝或异种动物身上提取的肝细胞仍然可以移植。(6)风险降低。可使用自体细胞进行移植，降低了免疫排斥的风险。然而，人类肝细胞的应用也受限于供体肝脏的短缺。因此，研究移植肝细胞的可用和可再生来源是非常有必要和迫切的。
2、原代肝细胞具有最佳的肝细胞功能，是肝细胞移植细胞来源的最优选择。然而，原代肝细胞的体外培养极其困难，短时间内肝细胞形态就会改变，肝细胞功能急剧降低甚至完全丢失，进而发生细胞衰老和死亡。多年来全世界研究者都在努力试图攻克这一难题，然而一直未能得以有效解决。研究表明肝细胞在体内可转化为胆管样前体细胞来逃避损伤，这些细胞在损伤因素减轻后又可重新分化为肝细胞来修复肝脏，提示肝细胞可向肝前体样细胞转化。现有研究通过细胞重编程诱导成
3、目前，尚缺乏一种肝前体细胞体外扩增的方法。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术中的不足之处，本专利技术的目的是提供一种操作简单的肝前体细胞体外扩增的方法。
2、为了实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本申请提供一种肝前体细胞的体外扩增培养方法，用i型胶原蛋白、层粘连蛋白或纤连蛋白对细胞培养板进行包被，肝前体细胞能够在该包被条件下与重编程培养基培养基b共同作用，以实现肝前体细胞的体外扩增，并高表达肝前体细胞标志基因ck19和ck7，低或常规表达成熟肝细胞标志基因alb和hnf4a，较好的维持肝前体细胞的基因表达特性。肝前体细胞来自于上海市东方医院，其为上皮样形态。
3、进一步地，重编程培养基包括基础培养基和添加组分，基础培养基包括advanceddmem/f12、低糖dmem或高糖dmem中的任意一种；添加组分包括表皮生长因子egf、肝细胞生长因子hgf、chir 99021、y 27632、鞘氨醇磷酸盐s1p、溶血磷脂酸lpa、a83 01、胎牛血清、n2添加物或b27添加物中的一种或多种的组合。
4、进一步地，低糖dmem中的葡萄糖浓度为0.5-1.5g/l；高糖dmem中的葡萄糖浓度为3.5-6g/l；表皮生长因子egf的浓度为15-25ng/ml、肝细胞生长因子hgf的浓度为15-25ng/ml，chir 99021的浓度为2-4μm，y 27632的浓度为7-12μm，鞘氨醇磷酸盐s1p的浓度为0.7-2μm，lpa的浓度为3-7μm，a83 01的浓度为0.7-2μm，胎牛血清的浓度为5-12％，n2添加物的浓度为0.5±0.1倍，b27添加物的浓度为0.5±0.1倍。
5、更进一步地，低糖为葡萄糖浓度1±0.2g/l；高糖为葡萄糖浓度4±0.5g/l或4±0.2g/l。
6、进一步地，肝前体细胞培养板包被材料为基质胶，用遇冷的pbs稀释基质胶母液，使其包被浓度为0.0264-100μg/cm2，37℃孵育0.5h，吸出工作液。
7、进一步地，用无菌乙酸溶液稀释i型胶原蛋白，使其包被浓度为0.0016-5μg/cm2，室温孵育1h，吸出工作液，pbs清洗3次。
8、进一步地，用无菌水溶解稀释层粘连蛋白，使其包被浓度为0.0016-5μg/cm2，室温孵育1h，吸出工作液，pbs清洗3次。
9、进一步地，用无菌水溶解稀释纤连蛋白，使其包被浓度为0.0016-5μg/cm2，室温孵育1h，吸出工作液，pbs清洗3次。
10、进一步地，肝前体细胞在重编程培养基中重悬制备细胞悬液，肝前体细胞的起始接种密度为2×104-5×105cells/ml。
11、有益效果：本专利技术的肝前体细胞体外扩增培养方法在操作上更为简便，成本上更为经济，安全性上更为可靠，且能够有效维持肝前体细胞的特性，对于推动肝细胞移植研究和相关疾病模型的建立具有重要的意义。
12、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
13、(1)操作简便性：传统的肝前体细胞培养方法常使用matrigel作为细胞培养板的包被材料，其配制过程需要在低温条件下进行，操作复杂且容易受到污染。本专利技术采用i型胶原蛋白、层粘连蛋白或纤连蛋白代替matrigel，这些材料可以在室温下进行配制和包被，大大简化了操作步骤，降低了对实验条件的要求，提高了实验的可重复性和成功率。
14、(2)成本效益：matrigel作为一种动物源性基质，其价格昂贵，且供应可能受到限制。本专利技术所使用的替代材料如i型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白，不仅来源广泛，而且成本相对较低，这使得大规模的肝前体细胞培养成为可能，同时也降低了研究和应用的成本。
15、(2)安全性提升：matrigel的动物源性可能带来潜在的免疫原性和病毒污染风险。与之相比，本专利技术中使用的重组蛋白如层粘连蛋白和纤连蛋白，具有更低的免疫原性和更高的安全性，减少了对细胞培养的影响，提高了细胞培养的稳定性和可靠性。
16、(3)细胞特性维持：本专利技术的方法不仅能够支持肝前体细胞的扩增，还能有效地维持这些细胞的基因表达特性。通过使用本专利技术的方法，肝前体细胞能够高表达肝前体细胞标志基因ck19和ck7，同时低或常规表达成熟肝细胞标志基因alb和hnf4a，这对于研究肝前体细胞的生物学特性和开发细胞治疗策略具有重要意义。
17、(4)促进肝细胞移植研究：本专利技术提供了一种有效的肝前体细胞扩增方法，这对于肝细胞移植研究具有重要的推动作用。通过扩增得到的肝前体细胞可以用于移植，有望成为治疗终末期肝病和肝脏代谢缺陷等疾病的新途径。
18、(5)促进相关疾病模型的建立：通过本专利技术的方法扩增得到的肝前体细胞，可以用于建立相关疾病模型，为肝病的研究和药物筛选提供重要的实验材料。
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1.一种肝前体细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：用I型胶原蛋白、层粘连蛋白或纤连蛋白对细胞培养板进行包被，肝前体细胞能够在该包被条件下与重编程培养基共同作用，以实现肝前体细胞的体外扩增，并高表达肝前体细胞标志基因CK19和CK7，低或常规表达成熟肝细胞标志基因ALB和HNF4A，较好的维持肝前体细胞的基因表达特性。
2.根据权利要求1所述的肝前体细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：重编程培养基包括基础培养基和添加组分；基础培养基包括Advanced DMEM/F12、低糖DMEM或高糖DMEM中的任意一种；所述添加组分包括表皮生长因子EGF、肝细胞生长因子HGF、CHIR 99021、Y27632、鞘氨醇磷酸盐S1P、溶血磷脂酸LPA、A83 01、胎牛血清、N2添加物或B27添加物中的一种或多种的组合。
3.根据权利要求1所述的肝前体细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：所述低糖DMEM中的葡萄糖浓度为0.5-1.5g/L，所述高糖DMEM中的葡萄糖浓度为3.5-6g/L；所述表皮生长因子EGF的浓度为15-25ng/ml，所述肝细胞生长因子HGF的浓度
4.根据权利要求1所述的肝前体细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：所述低糖为葡萄糖浓度1±0.2g/L；所述高糖为葡萄糖浓度4±0.5g/L或4±0.2g/L。
5.根据权利要求1所述的肝前体细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：所述肝前体细胞培养板包被材料为基质胶，用遇冷的PBS稀释基质胶母液，使其包被浓度为0.0264-100μg/cm2，37℃孵育0.5h，吸出工作液。
6.根据权利要求1所述的肝前体细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：用无菌乙酸溶液稀释I型胶原蛋白，使其包被浓度为0.0016-5μg/cm2，室温孵育1h，吸出工作液，PBS清洗3次。
7.根据权利要求1所述的肝前体细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：用无菌水溶解稀释层粘连蛋白，使其包被浓度为0.0016-5μg/cm2，室温孵育1h，吸出工作液，PBS清洗3次。
8.根据权利要求1所述的肝前体细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：用无菌水溶解稀释纤连蛋白，使其包被浓度为0.0016-5μg/cm2，室温孵育1h，吸出工作液，PBS清洗3次。
9.根据权利要求3所述的肝前体细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：所述肝前体细胞在重编程培养基中重悬制备细胞悬液，肝前体细胞的起始接种密度为2×104-5×105cells/ml。
...【技术特征摘要】
1.一种肝前体细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：用i型胶原蛋白、层粘连蛋白或纤连蛋白对细胞培养板进行包被，肝前体细胞能够在该包被条件下与重编程培养基共同作用，以实现肝前体细胞的体外扩增，并高表达肝前体细胞标志基因ck19和ck7，低或常规表达成熟肝细胞标志基因alb和hnf4a，较好的维持肝前体细胞的基因表达特性。
2.根据权利要求1所述的肝前体细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：重编程培养基包括基础培养基和添加组分；基础培养基包括advanced dmem/f12、低糖dmem或高糖dmem中的任意一种；所述添加组分包括表皮生长因子egf、肝细胞生长因子hgf、chir 99021、y27632、鞘氨醇磷酸盐s1p、溶血磷脂酸lpa、a83 01、胎牛血清、n2添加物或b27添加物中的一种或多种的组合。
3.根据权利要求1所述的肝前体细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：所述低糖dmem中的葡萄糖浓度为0.5-1.5g/l，所述高糖dmem中的葡萄糖浓度为3.5-6g/l；所述表皮生长因子egf的浓度为15-25ng/ml，所述肝细胞生长因子hgf的浓度为15-25ng/ml，所述chir99021的浓度为2-4μm，所述y 27632的浓度为7-12μm，所述鞘氨醇磷酸盐s1p的浓度为0.7-2μm，所述lpa的浓度为3-7μm，所述a83 01的浓度为0.7-2μm，所述胎牛血清的浓度为5-12％，所述n2...
【专利技术属性】
技术研发人员：白硕，李蕊，菅红磊，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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