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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及突触体相关蛋白检测领域,具体地涉及测定肉毒毒素活性或突触体相关蛋白的检测产品及方法。
技术介绍
1、突触体相关蛋白25 kda(synaptosome-associated protein of 25 kda,snap25)是由oyler等人首次鉴定的一种小的25 kda(206个氨基酸)螺旋蛋白。它由两种亚型snap25a和snap25b组成,并且分别出现在神经发育的不同阶段。在结构上,snap25是一个螺旋蛋白,两个α-螺旋的snap25和另外两个螺旋囊泡相关膜蛋白(vesicle-associatedmembrane protein,vamp)和突触融合蛋白(syntaxin,stx)共同组成可溶性n-乙酰-马来酰胺-敏感因子-附着蛋白受体(soluble n-ethylmaleimide-sensitive factor attachmentprotein receptor,snare)复合物。功能上,snap25参与突触前神经递质的释放。并且,残基180-197在钙动力学调节中起到关键作用。此外,snap25的c端拉链也被发现引发了snare复合物的融合孔开放和构象变化。
2、肉毒毒素(botulinum toxins,bonts)是一种已知对人类毒性最强的天然蛋白质毒素,对人的半数致死量为0.1-1.0 ng/kg。bonts进入细胞后通过裂解snare蛋白来阻断神经肌肉连接处神经递质的释放,最终导致松驰型神经麻痹。因此,bonts被广泛用作治疗神经系统相关疾病及美容行业,如慢性偏头痛、三叉
3、目前仍需要开发一种抗hsnap25人源单链抗体并建立不同血清的肉毒毒素活性检测方法。
4、
技术介绍
中的信息仅仅在于说明本专利技术的总体背景,不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
1、为解决现有技术中的至少部分技术问题,本专利技术从人天然单链抗体文库筛选得到抗hsnap25人源单链抗体以保证抗体全人源化,再借助基因工程技术构建出真核表达载体,并在真核细胞293f中进行表达。此外,本专利技术将筛选的抗hsnap25全人源单链抗体转变为特异性全人源完整的hsnap25-igg1抗体,再对其进行分离纯化,对其特异性和亲和力等生物特性进行评价,从而建立bont/a、bont/c和bont/e活性检测方法。具体地,本专利技术包括以下内容。
2、本专利技术的第一方面,提供一种测定肉毒毒素活性的方法,所述测定肉毒毒素活性的方法包括以下步骤:
3、(a) 在肉毒毒素足以发挥其生物活性的时间和条件下使其与snap25蛋白接触,得到肉毒毒素切割的snap25;
4、(b) 在适于抗体或其抗原结合片段与所述肉毒毒素切割的snap25结合的条件下使所述抗体或其抗原结合片段与所述肉毒毒素切割的snap25接触,得到第一复合物,其中所述抗体或其抗原结合片段包括氨基酸序列如seq id no.1-3所示的重链cdr1-3和/或氨基酸序列如seq id no.4-6所示的轻链cdr1-3;
5、(c) 在适于检测抗体与所述第一复合物结合的条件下使检测抗体与所述第一复合物接触,得到第二复合物;
6、(d) 测定第二复合物的量并确定肉毒毒素活性。
7、在某些实施方案中,根据本专利技术所述的测定肉毒毒素活性的方法,其中,所述检测抗体为碱性磷酸酶结合抗体、辣根过氧化物酶结合抗体或荧光染料结合的抗体。
8、本专利技术的第二方面,提供一种检测snap25的方法,所述检测snap25的方法包括以下步骤:
9、(1)在足以形成抗体或其抗原结合片段/抗原复合物的时间和条件下,使样本与抗体或其抗原结合片段接触,其中,所述抗体或其抗原结合片段与所述样本中的snap25结合,所述抗体或其抗原结合片段包括氨基酸序列如seq id no.1-3所示的重链cdr1-3和/或氨基酸序列如seq id no.4-6所示的轻链cdr1-3;
10、(2)测定所述样本与抗体或其抗原结合片段的结合,或确定所述抗体或其抗原结合片段/抗原复合物的存在,以确定所述样本中snap25的存在。
11、本专利技术的第三方面,提供一种抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段能够靶向snap25,所述抗体或其抗原结合片段包括氨基酸序列如seq id no.1-3所示的重链cdr1-3和/或氨基酸序列如seq id no.4-6所示的轻链cdr1-3。
12、在某些实施方案中,根据本专利技术所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体或其抗原结合片段具有(i)-(iii)所示的任意一种氨基酸序列:
13、(i) 包含seq id no.7所示的重链氨基酸序列和/或seq id no.8所示的轻链氨基酸序列;
14、(ii) 与(i)所示的氨基酸序列具有至少90%同源性,且具有相同功能的氨基酸序列;
15、(iii) 与(i)或(ii)所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多于一个氨基酸获得的且具有相同功能的氨基酸序列。
16、在某些实施方案中,根据本专利技术所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体包括单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体;所述抗原结合片段包括fab(指包含了整个可变区(vh和vl)以及恒定区ch1的片段)、fab’(去除可结晶区的片段)、f(ab)2(以二硫键连接的片段)、f(ab’)2(去除可结晶区的以二硫键连接的片段)或scfv(单链可变片段)。
17、本专利技术的第四方面,提供一种核酸分子,所述核酸分子包含编码本专利技术所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
18、本专利技术的第五方面,提供一种载体分子,所述载体分子包含本专利技术所述的核酸分子。
19、本专利技术的第六方面,提供一种宿主细胞,所述宿主细胞包含本专利技术所述的核酸分子或载体分子。
20、本专利技术的第七方面,提供一种抗体或其抗原结合片段的制备方法,所述抗体或其抗原结合片段通过人工合成或基因工程方式制备。
21、本专利技术的第八方面,提供一种检测产品,其中,所述检测产品包括试剂盒、试纸条或蛋白芯片,所述检测产品用于检测snap25或用于测定肉毒毒素活性,所述检测产品包含本专利技术所述的抗体或其抗原结合片段。
22、虽然目前商业化的snap25抗体常被用来检测肉毒毒素的生物活性。但多数snap25为动物源(包括鼠源、兔源等)的多克隆或单克隆抗体。动物源单克隆抗体是通过杂交瘤技术生产,需要经过动物免疫、复杂的杂交瘤融合及筛选等过程,整个周期的时间较长,重复生产性能差。而本专利技术通过噬菌体展示技术实现了在每个阶段对实验进行完全控制,实验周期相对较短,产生大容量的抗体库并可重组产生不同类型的抗体,适合产业化制备。本专利技术制备的抗体具有良好的特异性,而且亲和力优于商品化动物来源的sna本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 检测产品,其特征在于,所述检测产品包括试剂盒、试纸条或蛋白芯片,所述检测产品用于检测突触体相关蛋白或用于测定肉毒毒素活性,所述检测产品包括抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的重链CDR1-3和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示的轻链CDR1-3。
2.一种测定肉毒毒素活性的方法,其特征在于,所述测定肉毒毒素活性的方法包括以下步骤:
3.一种检测突触体相关蛋白的方法,其特征在于,所述检测突触体相关蛋白的方法包括以下步骤:
4. 抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段能够靶向突触体相关蛋白,所述抗体或其抗原结合片段包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的重链CDR1-3和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示的轻链CDR1-3。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段具有(I)-(III)所示的任意一种氨基酸序列:
6.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于
7.核酸分子,其特征在于,所述核酸分子包含编码根据权利要求4-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
8.载体分子,其特征在于,所述载体分子包含根据权利要求7所述的核酸分子。
9.宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞包含根据权利要求7所述的核酸分子或根据权利要求8所述的载体分子。
10.根据权利要求4-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的制备方法,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段通过人工合成或基因工程方式制备。
...【技术特征摘要】
1. 检测产品,其特征在于,所述检测产品包括试剂盒、试纸条或蛋白芯片,所述检测产品用于检测突触体相关蛋白或用于测定肉毒毒素活性,所述检测产品包括抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包括氨基酸序列如seq id no.1-3所示的重链cdr1-3和/或氨基酸序列如seq id no.4-6所示的轻链cdr1-3。
2.一种测定肉毒毒素活性的方法,其特征在于,所述测定肉毒毒素活性的方法包括以下步骤:
3.一种检测突触体相关蛋白的方法,其特征在于,所述检测突触体相关蛋白的方法包括以下步骤:
4. 抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段能够靶向突触体相关蛋白,所述抗体或其抗原结合片段包括氨基酸序列如seq id no.1-3所示的重链cdr1-3和/或氨基酸序列如seq id no.4-6所示的轻链cdr1-3。
5....
【专利技术属性】
技术研发人员:杨克娜,杨英超,张若晖,朱衍志,李娅聪,许艳,
申请(专利权)人:兰州生物技术开发有限公司,
类型:发明
国别省市:
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