【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
技术实现思路
1、低水平分析物(例如蛋白质和核酸)的测量对于临床诊断应用是重要的，但由于灵敏度不足而仍具挑战性。已开发了单分子阵列(simoa)等超灵敏数字elisa技术，以实现对非常低浓度的疾病相关蛋白的检测，但仍面临诸如大且复杂的仪器、高成本且复杂的工作流程等限制，使得床旁应用不切实际。此外，仍有许多潜在疾病生物标志物以低于当前数字检测方法的检测限存在。
2、本文记载了解决上述挑战的超灵敏检测方法。本专利技术方法的大大简化的读出过程和改善的成本效益可以促进与poc系统的潜在集成。特别地，本专利技术提供了一种简化的数字elisa技术，即用于个体计数的分子珠上信号放大(molecular on-bead signalamplification for individual counting,mosaic)，其实现了阿托摩尔的灵敏度并且仅需要常规的实验室基础设施，因此极大地提高了超灵敏蛋白检测的可及性。本专利技术使用珠上信号生成，因此无需将珠分离到单独的容器如微孔或液滴中以进行信号区室化(compartmentalization)，并且消除了对复杂微加工或液滴生成的需要。
3、此外，本专利技术聚焦于使用流式细胞术作为检测方法，流式细胞术对许多研究实验室而言易于获取且还可以低成本适用于微流体系统，使得本专利技术更适于快速并入现有实验室基础设施和床旁制式中(asghari,m.et al.scientific reports 2017,7(1)12342)。通过整
4、除应用快速珠上信号放大策略之外，mosaic的高取样效率可被用于系统地减少测定珠数目以增强检测低阿托摩尔蛋白浓度的灵敏度。mosaic的改善的灵敏度使测量生物流体中原先不可检测的分析物(例如唾液中的低丰度细胞因子)成为可能。此外，mosaic扩展了数字elisa的多路复用能力，因为可以在单个样品中分析的珠类型的数量不再受限于微孔或其它区室的总数。作为mosaic中增加的多路复用的实例，已使用低体积的血浆以阿托摩尔至低飞摩尔的灵敏度同时测量了八个蛋白质目标。
5、mosaic的与现有的数字elisa方法相比改善的灵敏度、简便性和多功能性为使超灵敏蛋白质检测可广泛获得和发现用于不同临床应用的先前不可检测的生物标志物提供了相当大的进步。
6、因此，在一个方面，本专利技术提供了一种检测样品中目标分析物的方法，所述方法包括：(a)使含有或疑似含有所述目标分析物的样品与包括特异性结合至所述目标分析物的捕获部分的多个珠在足以使所述样品中的所述目标分析物结合至所述捕获部分的条件和时间下接触，其中多个所述珠与零个目标分析物分子缔合，其中多个所述珠与一个目标分析物分子缔合，其中至少约20％的所述珠与零个或一个目标分析物分子缔合；(b)使步骤(a)的产物与结合至所述目标分析物的检测部分接触，(c)使步骤(b)的产物与结合至所述检测部分的信号放大部分接触以生成针对携带所述目标分析物的每个珠的可检测信号；以及(d)通过流式细胞术检测所述可检测信号，从而检测所述样品中的所述目标分析物。
7、在一些实施方案中，所述珠包括磁珠、顺磁珠、非磁珠、多孔珠或玻璃珠。
8、在一些实施方案中，所述捕获部分包括抗体、适体、抗体模拟物、多肽、核酸、分子印迹聚合物、受体、结合蛋白或小分子。
9、在一些实施方案中，所述检测部分包括抗体、适体、抗体模拟物、多肽、核酸、分子印迹聚合物、受体、结合蛋白或小分子。
10、在一些实施方案中，所述信号放大部分包含酶和/或核酸分子。
11、在一些实施方案中，所述可检测信号的产生是通过滚环扩增、接着与互补的荧光标记的dna探针杂交；滚环转录；杂交链式反应；环介导等温扩增；自由基聚合；酪酰胺信号放大(tyramide signal amplification,tsa)；酶催化邻近标记(proximity labeling,pl)聚合；通过用荧光标记的酶、纳米颗粒或核酸多联体的预放大信号进行标记；基于聚合的信号放大；或磁珠-量子点免疫测定。
12、在一些实施方案中，至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的珠与零个或一个目标分析物分子缔合。
13、在一些实施方案中，所述检测部分和所述信号放大部分直接连接。
14、在一些实施方案中，所述检测部分和所述信号放大部分通过非共价亲和结合对连接，其中所述检测部分连接至所述非共价亲和结合对的第一成员，并且所述信号放大部分连接至所述非共价亲和结合对的第二成员。
15、在一些实施方案中，所述非共价亲和结合对是生物素-链霉亲和素、生物素-亲和素、配体-受体、抗原-抗体或抗体结合蛋白-抗体。
16、在一些实施方案中，包括用于所述目标分析物的所述捕获部分的所述珠不同于包括用于非目标分析物的捕获部分的珠，任选地，具有不同的颜色、形状或尺寸。
17、在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过流式细胞术检测包括所述捕获部分的所述珠。
18、在一些实施方案中，所述方法降低交叉反应性或非特异性结合。在一些实施方案中，所述交叉反应性或非特异性结合是通过经由流式细胞术检测所述珠和所述可检测信号来降低的。
19、在一些实施方案中，所述目标分析物是蛋白质、核酸、多糖、脂质、细胞、脂肪酸、治疗剂、有机体、病毒、毒素、肽、寡糖、脂蛋白、糖蛋白、聚糖或激素。
20、在一些实施方案中，所述样品包括生物样品、环境样品或合成物质。
21、在一些实施方案中，所述生物样品是(i)选自淋巴液、全血、血浆、血清、含外周血单核细胞的血液级分、尿液、唾液、精液、汗液、泪液、滑液、脑脊液、粪便、粘液、阴道液和脊髓液的体液，或(ii)乳腺组织、肝组织、胰腺组织、宫颈组织、肺组织、肾组织、结肠组织、脑组织、肌肉组织、滑膜组织、皮肤、毛囊、骨髓、肿瘤组织、组织裂解物或匀浆物、或器官裂解物或匀浆物。
22、在一些实施方案中，所述生物样品是血浆。
23、在一些实施方案中，所述生物样品是唾液。
24、在一些实施方案中，所述方法进一步包括测量所述样品中所述目标分析物的浓度，其中所述样品中所述目标分析物的所述浓度与所述可检测信号的水平相关。
25、在一些实施方案中，其进一步包括检测或测量所述样品中的额外目标分析物的浓度。
26、在一些本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测样品中目标分析物的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述珠包括磁珠、顺磁珠、非磁珠、多孔珠或玻璃珠。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述捕获部分包括抗体、适体、抗体模拟物、多肽、核酸、分子印迹聚合物、受体或小分子。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述检测部分包括抗体、适体、抗体模拟物、多肽、核酸、分子印迹聚合物、受体、结合蛋白或小分子。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述信号放大部分包含酶和/或核酸分子。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述可检测信号的产生是通过滚环扩增、接着与互补的荧光标记的DNA探针杂交；滚环转录；杂交链式反应；环介导等温扩增；自由基聚合；酪酰胺信号放大(TSA)；酶催化邻近标记(PL)聚合；通过用荧光标记的酶、纳米颗粒或核酸多联体的预放大信号进行标记；基于聚合的信号放大；或磁珠-量子点免疫测定。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述检测部分和所述信号放大部分直接连接。
9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述检测部分和所述信号放大部分通过非共价亲和结合对连接，其中所述检测部分连接至所述非共价亲和结合对的第一成员，并且所述信号放大部分连接至所述非共价亲和结合对的第二成员。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述非共价亲和结合对是生物素-链霉亲和素、生物素-亲和素、配体-受体、抗原-抗体或抗体结合蛋白-抗体。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中包括用于所述目标分析物的所述捕获部分的所述珠不同于包括用于非目标分析物的捕获部分的珠，任选地，具有不同的颜色、形状或尺寸。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其进一步包括通过流式细胞术检测包括所述捕获部分的所述珠。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述方法降低交叉反应性或非特异性结合。
14.如权利要求13所述的方法，其中通过经由流式细胞术检测所述珠和所述可检测信号来降低所述交叉反应性或非特异性结合。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述目标分析物是蛋白质、核酸、多糖、脂质、细胞、脂肪酸、治疗剂、有机体、病毒、毒素、肽、寡糖、脂蛋白、糖蛋白、聚糖或激素。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述样品包括生物样品。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述生物样品是(i)选自淋巴液、全血、血浆、血清、含外周血单核细胞的血液级分、尿液、唾液、精液、汗液、泪液、滑液、脑脊液、粪便、粘液、阴道液和脊髓液的体液，或(ii)乳腺组织、肝组织、胰腺组织、宫颈组织、肺组织、肾组织、结肠组织、脑组织、肌肉组织、滑膜组织、皮肤、毛囊、骨髓、肿瘤组织、组织裂解物或匀浆物、或器官裂解物或匀浆物。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述生物样品是血浆。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述生物样品是唾液。
20.如权利要求1-18中任一项所述所述的方法，其中步骤(a)、(b)、(c)或其任何组合顺序地或同时地进行。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其进一步包括测量所述样品中所述目标分析物的浓度，其中所述样品中所述目标分析物的所述浓度与所述可检测信号的水平成比例。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其进一步包括检测或测量所述样品中的额外目标分析物的浓度。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述额外目标分析物包括一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种目标分析物。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述额外目标分析物是蛋白质、核酸、多糖、脂质、细胞、脂肪酸、治疗剂、有机体、病毒、毒素、肽、寡糖、脂蛋白、糖蛋白、聚糖或激素。
25.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其进一步包括使所述样品与以下接触，(i)包括特异性结合至所述额外目标分析物的额外捕获部分的多个珠；(ii)结合至所述额外目标分析物的额外检测部分，以及(iii)结合至所述额外检测部分以产生额外检测信号的额外信号放大部分。
26.一种检测样品中的第一目标分析物和第二目标分析物的方法，所述方法包括：
27.如权利要求26所述的方法，其中所...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种检测样品中目标分析物的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述珠包括磁珠、顺磁珠、非磁珠、多孔珠或玻璃珠。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述捕获部分包括抗体、适体、抗体模拟物、多肽、核酸、分子印迹聚合物、受体或小分子。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述检测部分包括抗体、适体、抗体模拟物、多肽、核酸、分子印迹聚合物、受体、结合蛋白或小分子。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述信号放大部分包含酶和/或核酸分子。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述可检测信号的产生是通过滚环扩增、接着与互补的荧光标记的dna探针杂交；滚环转录；杂交链式反应；环介导等温扩增；自由基聚合；酪酰胺信号放大(tsa)；酶催化邻近标记(pl)聚合；通过用荧光标记的酶、纳米颗粒或核酸多联体的预放大信号进行标记；基于聚合的信号放大；或磁珠-量子点免疫测定。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的珠与零个或一个目标分析物分子缔合。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述检测部分和所述信号放大部分直接连接。
9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述检测部分和所述信号放大部分通过非共价亲和结合对连接，其中所述检测部分连接至所述非共价亲和结合对的第一成员，并且所述信号放大部分连接至所述非共价亲和结合对的第二成员。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述非共价亲和结合对是生物素-链霉亲和素、生物素-亲和素、配体-受体、抗原-抗体或抗体结合蛋白-抗体。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中包括用于所述目标分析物的所述捕获部分的所述珠不同于包括用于非目标分析物的捕获部分的珠，任选地，具有不同的颜色、形状或尺寸。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其进一步包括通过流式细胞术检测包括所述捕获部分的所述珠。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述方法降低交叉反应性或非特异性结合。
14.如权利要求13所述的方法，其中通过经由流式细胞术检测所述珠和所述可检测信号来降低所述交叉反应性或非特异性结合。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述目标分析物是蛋白质、核酸、多糖、脂质、细胞、脂肪酸、治疗剂、有机体、病毒、毒素、肽、寡糖、脂蛋白、糖蛋白、聚糖或激素。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述样品包括生物样品。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述生物样品是(i)选自淋巴液、全血、血浆、血清、含外周血单核细胞的血液级分、尿液、唾液、精液、汗液、泪液、滑液、脑脊液、粪便、粘液、阴道液和脊髓液的体液，或(ii)乳腺组织、肝组织、胰腺组织、宫颈组织、肺组织、肾组织、结肠组织、脑组织、肌肉组织、滑膜组织、皮肤、毛囊、骨髓、肿瘤组织、组织裂解物或匀浆物、或器官裂解物或匀浆物。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述生物样品是血浆。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述生物样品是唾液。
20.如权利要求1-18中任一项所述所述的方法，其中步骤(a)、(b)、(c)或其任何组合顺序地或同时地进行。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其进一步包括测量所述样品中所述目标分析物的浓度，其中所述样品中所述目标...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·R·瓦尔特，C·吴，R·诺瓦克，T·杜根，R·艾哈迈德，
申请(专利权)人：哈佛学院院长等，
类型：发明
国别省市：
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