【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物学免疫层析检测方法领域，具体涉及了一种用胶体金方法检测醛酮还原酶1b10(akr1b10)蛋白含量的定性试剂盒及其应用。
技术介绍
1、肝脏是人体重要的代谢和解毒器官，参与人体的生物转化和代谢。肝部疾病根据发展进程主要分为肝炎、脂肪肝、酒精肝、血吸虫肝、肝硬化、肝癌。肝炎患者由于酒精、病毒、药物等因素导致肝部炎症等致病，调查表明，在疾病的初期只有约1/10的乙型肝炎患者察觉并接受治疗，因此肝脏造成持续性损害，导致肝星状细胞(hscs)活化和细胞外基质过度沉积，慢性肝炎患者逐渐发展为肝纤维化、肝硬化和肝癌。肝部疾病由于发病率高、隐秘性高、疾病发展迅速等特点，已成为威胁人类健康的重要因素。因此，开发一款早期检测、疗效判断、预后评估或复发监测的快速诊断方法对肝部疾病的诊断和治疗具有重要价值。
2、醛酮还原酶1b10(aldo-keto reductase 1b10,akr1b10)是一种人烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)依赖性还原酶，属于醛酮还原酶(akr)1b亚家族，其分子量为36.02kda，akr1b10在hcc等多种肿瘤与肝部、胃肠道等多种疾病中发挥关键作用，包括但不限于脂肪生成、氧化应激、细胞毒性反应性羰基的解毒和s1p的调节，是一种新型的肿瘤与良性疾病之组织及血清标记物，在疾病发生、诊断、治疗、预后等具有非常好的应用价值。
3、目前，akr1b10的检测方法为磁微粒化学发光法和时间分辨免疫荧光分析法，此类方法为定量检测方法，具有准确度高，灵敏度高，重复性好等优点。但是需要配备
技术实现思路
1、针对上述问题，我们提供了一种用胶体金方法检测醛酮还原酶1b10(akr1b10)蛋白含量的定性试剂盒及其应用。旨在解决上述现有技术存在的问题，本专利技术制备的试剂盒具有反应快速、灵敏度高、检测操作简便、经济实用等优点。
2、本专利技术是一种用胶体金方法检测醛酮还原酶1b10(akr1b10)蛋白含量的定性试剂盒，采用双抗体夹心法实现对人血清中akr1b10蛋白的检测，包括如下组分：样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫和pvc底板。
3、其中，胶体金垫上包被有鼠抗akr1b10单克隆抗体，层析膜上包被有抗akr1b10抗体的检测线(t线)。受试者的血清样品滴在样品垫上，样品在毛细作用下移动。若样品中存在醛酮还原酶1b10(akr1b10)蛋白，则会与胶体金结合垫上胶体金标记的抗体结合，并继续向前移动，并在检测线处与另一特异性抗体结合。由于胶体金标记的抗体在t线上聚集，因此胶体金在此处沉淀聚焦显现为红色。通过肉眼进行可进行定性判断。
4、层析膜上还包被有羊抗鼠igg的质控线(c线)，若受试者检测后，在检测线和质控线处都有条带，则说明检测为阳性。当在检测线处未观察到条带时为阴性。若检测线和质控线均无条带，或检测线有条带而质控线无条带，说明试剂盒有问题，应进行更换。
5、胶体金垫上包被有鼠抗akr1b10单克隆抗体，层析膜上包被有抗akr1b10抗体的检测线、包被有羊抗鼠igg的质控线，其中鼠抗akr1b10单克隆抗体采用杂交瘤细胞细胞技术制备而来，所述检测抗体是akr1b10蛋白免疫兔后获得的akr1b10多克隆抗体，所诉羊抗鼠igg抗体为识别抗体fc片段商用抗体。
6、优选地，所述胶体金包被的两种鼠抗akr1b10单克隆抗体的浓度为20μg/ml；所述两种抗体为4e11和8d09。所述两种优选的特异性单克隆抗体进行克隆和测序，序列如下：
7、一种命名为4e11的单克隆抗体，它的重链可变区由118个氨基酸残基组成，轻链可变区由112个氨基酸残基组成；一种命名为8d09的单克隆抗体，它的重链可变区由126个氨基酸残基组成，轻链可变区由117个氨基酸残基组成：
8、vh(4e11)：esivntiscltsspglpseqlshgyycekfellewigvdcyfsmrgqgta ynkiysydntfpnaietelthrwvmdtltlicccqtsfksyvwpgsepepeekwiwccdks dsglqvt。
9、vl(4e11)：iyycslgeiknhrnstseltfksyvvlnipvqkewliypvllyccdrrmt nlffsewdksiyrsmntaksreegiwmdvsvraplassdlgvvhacktikyliesyydepa a。
10、vh(8d09)：lvelgsgragsnlgtygnyvetlniqhirtsgsgvasefmvkqlgirtwifksynpggsnwvkihsgvscgnyvvcm cmvaymelfsdntnlgtdqikvsekfkshgkrllisnikvsgswgqvvk。
11、vl(8d09)：slfygayfppwllivsatttkihwngsnnymtmtkhsgrsktkqiewf rfmckikikgiyksmewwnpagselftiliynvssgsalgfygsayscksfygraaiewttr nylgtmt。
12、优选地，所述检测线包被的兔抗akr1b10多克隆抗体的浓度为1mg/ml。
13、优选地，所述质控线包被的羊抗鼠igg的浓度为1mg/ml。
14、本专利技术提供所述的试剂盒在制备筛查、诊断肿瘤的检测试剂中的应用，优选地，所述利用所述的试剂盒采用双抗体夹心免疫检测法：待测样品中的醛酮还原酶1b10蛋白与胶体金包被抗体结合，待移动到检测线位置再与检测抗体结合，胶体金在检测线聚集而显色；
15、具体地，所述肿瘤是肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、胆管、胃肠道癌等肿瘤，及肝炎、肝硬化、脂肪肝、酒精肝、非酒精性脂肪肝、血吸虫肝、溃疡性结肠炎、克隆氏病；
16、具体地，待测样本包括血清、血浆、全血、尿液、唾液、大便提取物、口腔或人体组织提取物。
17、本专利技术还公开了上述akr1b10的胶体金免疫层析检测卡的制备方法，包括以下步骤：制备胶体金-4e11和胶体金-8d09混合液，将金标溶液固定在胶体金垫上；将兔抗醛酮还原酶1b10多克隆抗体和羊抗鼠igg作为检测线和质控线抗体固定层析膜nc膜上，将结合垫贴在层析膜nc的前端，再将样品垫贴在结合垫的前端，最后将吸水纸的前端贴在层析膜的后端，另一端贴在pvc板的末端，即完成试剂盒的组装。
18、更具体地，包括如下步骤：
19、1.hau本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速检测醛酮还原酶1B10的试剂盒，所述的试剂盒由样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫和PVC底板组成，所述样品垫、胶体金结合垫、层析膜和吸水垫依次搭接在PVC底板上，其特征在于：所述的胶体金垫上包被有鼠抗醛酮还原酶1B10的单克隆抗体，层析膜上包被有抗醛酮还原酶1B10的抗体的检测线、包被有羊抗鼠IgG的质控线。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的胶体金与鼠抗醛酮还原酶1B10的单克隆抗体偶联的复合物固化于胶体金结合垫上，鼠抗醛酮还原酶1B10的单克隆抗体偶联的复合物浓度为15-25μg/mL（优选为20μg/mL）。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述胶体金垫包被有两种鼠抗醛酮还原酶1B10的单克隆抗体4E11和8D09，其是经过杂交瘤细胞技术制备且识别不同抗原表位。
4.如权利要3所述的试剂盒，其特征在于，所述胶体金垫包被两种鼠抗醛酮还原酶1B10的单克隆抗体的方法为胶体金分别包被4E11和8D09单克隆抗体，优选地两者按1：1比例混合固定于胶体金垫。
5.如权利要求3所述的胶体金检测试剂盒，
6.如权利要求3所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金偶联复合物采用金标缓冲液稀释，缓冲液为PBS缓冲液、tris-Hcl缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种。
7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的金标缓冲液浓度为0.01M缓冲液，PH为7.0-8.0，包含成分:0.5%～2.0%BSA，1.0%～2.0%蔗糖，0.5%～2.0%甘氨酸，1.0%～2.0%甘露醇，0.5%～2.0%明胶，0.01%～1.0%Tween 20，0.01%～0.10%Pclin 300。
8.权利要求1至7任一项所述的试剂盒在制备筛查、诊断肿瘤的检测试剂中的应用，优选地，所述利用权利要求1至7任一项所述的试剂盒采用双抗体夹心免疫检测法：待测样品中的醛酮还原酶1B10蛋白与胶体金包被抗体结合，待移动到检测线位置再与检测抗体结合，胶体金在检测线聚集而显色；
9.一种如权利要求3至7任一项所述的快速检测醛酮还原酶1B10的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种快速检测醛酮还原酶1b10的试剂盒，所述的试剂盒由样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫和pvc底板组成，所述样品垫、胶体金结合垫、层析膜和吸水垫依次搭接在pvc底板上，其特征在于：所述的胶体金垫上包被有鼠抗醛酮还原酶1b10的单克隆抗体，层析膜上包被有抗醛酮还原酶1b10的抗体的检测线、包被有羊抗鼠igg的质控线。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的胶体金与鼠抗醛酮还原酶1b10的单克隆抗体偶联的复合物固化于胶体金结合垫上，鼠抗醛酮还原酶1b10的单克隆抗体偶联的复合物浓度为15-25μg/ml（优选为20μg/ml）。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述胶体金垫包被有两种鼠抗醛酮还原酶1b10的单克隆抗体4e11和8d09，其是经过杂交瘤细胞技术制备且识别不同抗原表位。
4.如权利要3所述的试剂盒，其特征在于，所述胶体金垫包被两种鼠抗醛酮还原酶1b10的单克隆抗体的方法为胶体金分别包被4e11和8d09单克隆抗体，优选地两者按1：1比例混合固定于胶体金垫。
5.如权利要求3所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金垫采用胶体金垫缓冲液预处理，预处理液包括；0.01m 磷酸盐缓冲液，含1.0%～2%bsa,0.05%～...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹哲，
申请(专利权)人：湖南莱拓福生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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