【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于鱼类低温生物学及种质超低温冷冻保存的领域，特别涉及长江上游珍稀鱼类精子超低温冷冻保存液及其应用。
技术介绍
1、长江上游水系是长江鲟、胭脂鱼、岩原鲤等珍稀、特有鱼类的繁育地。但一段时期里，受污水乱排、过度捕捞、挖砂采石等破坏生态环境行为的影响，珍稀、特有鱼类一度面临生存危机。
2、长江上游特有、珍稀鱼类胭脂鱼(myxocyprinus asiaticus)是硬骨鱼纲、鲤形目、亚口鱼科、胭脂鱼属的一种广温性淡水鱼类，分布于长江干流及通江湖泊和中上游的主要支流，以及福建闽江水系中。岩原鲤(procypris rabaudi)是鲤科、原鲤属的一种广温性淡水鱼类，分布于长江重庆以上的干支流，嘉陵江、岷江、沱江、渠江、酉水、赤水河以及金沙江中下游等江河。岩原鲤的人工繁殖技术在重庆市三江水生生物研究所、武汉市湖北省水产科学研究所等单位完成了人工繁殖。多鳞白甲鱼(scaphesthes macrolepis)是鲤科、白甲鱼属的一种暖温性淡水鱼类，分布于长江支流嘉陵江水系和汉水水系的中上游、淮河上游、渭河水系、伊河、洛河、海河上游的滹沱和山东泰山的溪涧。该物种的人工繁殖技术获得突破。
3、鱼类精子冷冻保存技术在保护濒危鱼类遗传资源和保存优质遗传基因资源，以及鱼类杂交育种中发挥重要作用。利用精子的超低温冷冻保存技术进行种质资源的保存，对于种质资源的可持续利用和发展具有重要的作用和意义，一方面可以长期稳定的保存珍稀、特有鱼种的遗传资源；另一方面冷冻精子可以助力人工培育和扩大繁育珍稀、特有鱼种，助力珍稀特有物种的
4、因为精子的冷冻保存方案具有物种特异性，现有技术更多的是针对单一的物种进行设计，也有针对隶属于同一种属的鱼类进行设计的精子冷冻保存方案，比如海水鱼种的石斑鱼属的精子冷冻保存。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题在于提供一种长江上游珍稀鱼类精子超低温冷冻保存液及其应用。本专利技术针对同处在相同生长和繁殖环境的长江上游水系特有、珍稀鱼类的胭脂鱼、多鳞白甲鱼和岩原鲤的三种鱼的精子冷冻保存方案进行筛选和适用比较，筛选出适用于这三种鱼的冷冻保存方案，提高精子冷冻保存方案的适用广度，以及该项技术的实际利用率，更好的助力种质资源的可持续利用和发展。
2、一种长江上游珍稀鱼类精子超低温冷冻保存液，所述保存液的成分为100ml保存液含有0.8～1.0g氯化钠，0.04～0.06g氯化钾，1.3～1.7g葡萄糖，7.2～15ml二甲基亚砜量，所述的长江上游珍稀鱼为胭脂鱼、岩原鲤和多鳞白甲鱼。
3、作为优选的实施方式，所述保存液的成分为100ml保存液含有0.8g氯化钠，0.05g氯化钾，1.5g葡萄糖，抗冻剂为7.2～15ml二甲基亚砜，或者100ml保存液含有0.9g氯化钠，0.05g氯化钾，1.5g葡萄糖，抗冻剂为7.2～15ml二甲基亚砜。
4、具体的，本专利技术还提供一种多鳞白甲鱼精液的冷冻保存液，100ml所述的保存液含有0.9g氯化钠，0.05g氯化钾，1.5g葡萄糖，抗冻剂为7.2～15ml二甲基亚砜。
5、本专利技术还提供利用上述保存液对长江上游珍稀鱼类精子超低温冷冻保存的方法，所述方法如下包括精子采集和检测、冷冻保存液配制、精子与冷冻保存液混合、分装和预冷、平衡与冷冻保存、解冻和检测；
6、所述的精子与冷冻保存液混合为精液和冷冻保存液按1:2～1:5进行混合并混匀获得混合液；
7、所述的分装和预冷为用吸管吸取混合液，分装至冻存管，并在4℃冰箱预冷；
8、所述的平衡与冷冻保存为将装有混合液的冻存管置于透气袋中，再将透气袋置于-140℃～-150℃的液氮蒸汽中平衡10分钟，然后再将透气袋置于-180℃～-190℃的液氮蒸汽中平衡5分钟，然后沉入液氮中保存；
9、所述的解冻和检测为将从液氮中拿出的冻存管置于37℃～38℃的水浴锅中解冻，在显微镜下检查精子活力；
10、所述的长江上游珍稀鱼类为胭脂鱼、岩原鲤和多鳞白甲鱼精液。
11、作为优选的实施方案，每个冻存管中装有0.5-1.5ml的混合液。
12、作为优选的实施方案，当保存多鳞白甲鱼精子时，精液和冷冻保存液混合比例1：5，抗冻剂二甲基亚砜在精子和稀释液的混合液中的终浓度为体积比8％。
13、作为优选的实施方案，当保存胭脂鱼时，精液和冷冻保存液混合体积比为1：3，抗冻剂二甲基亚砜在精子和稀释液的混合液中的终浓度为体积比8％。
14、作为优选的实施方案，当保存岩原鲤精子时，精液和冷冻保存液混合体积比为1：2，抗冻剂二甲基亚砜在精子和稀释液的混合液中的终浓度为体积比8％。
15、作为优选的实施方案，所述的分装是在冰上进行，分装完毕后放在4℃预冷，分装和预冷的时间控制在25-30min，分装和预冷时间过长或过短会影响精子的冷冻保存效果。
16、本专利技术与现有技术对比的有益效果如下：
17、本专利技术的保存方案具有适用性广的特点，可用于长江珍稀鱼类胭脂鱼、岩原鲤和多鳞白甲鱼精子的冷冻保存，且解冻后精子活力高，胭脂鱼精子解冻后活力为72.04±4.91％、岩原鲤精子解冻后活力为56.25±1.15％、多鳞白甲鱼精子解冻后活力为67.95±4.12％，可用于遗传资源的长期稳定保存、人工培育和扩大繁育；冷冻保存液具有的成分简单、易于配制、携带方便的特点；利用2ml冷冻管进行大量保存，可快速建立冷冻精子库；保存精子的操作简单、设备要求低(液氮罐、保温泡沫箱)和实操性强的特点。
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1.一种长江上游珍稀鱼类精子超低温冷冻保存液，其特征在于，所述保存液的成分为100ml保存液含有0.8～1.0g氯化钠，0.04～0.06g氯化钾，1.3～1.7g葡萄糖，7.2～15ml二甲基亚砜量，所述的长江上游珍稀鱼为胭脂鱼、岩原鲤和多鳞白甲鱼。
2.根据权利要求1所述的一种长江上游珍稀鱼类精子超低温冷冻保存液，其特征在于，所述保存液的成分为100ml保存液含有0.8g氯化钠，0.05g氯化钾，1.5g葡萄糖，抗冻剂为7.2～15ml二甲基亚砜，或者100ml保存液含有0.9g氯化钠，0.05g氯化钾，1.5g葡萄糖，抗冻剂为7.2～15ml二甲基亚砜。
3.一种多鳞白甲鱼精液的冷冻保存液，100ml所述的保存液含有0.9g氯化钠，0.05g氯化钾，1.5g葡萄糖，抗冻剂为7.2～15ml二甲基亚砜。
4.利用权利要求1或2所述保存液对长江上游珍稀鱼类精子超低温冷冻保存的方法，所述方法如下包括精子采集和检测、冷冻保存液配制、精子与冷冻保存液混合、分装和预冷、平衡与冷冻保存、解冻和检测；
5.根据权利要求4所述的对长江上游珍稀鱼
6.根据权利要求4所述的对长江上游珍稀鱼类精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，保存多鳞白甲鱼精子时，精液和冷冻保存液混合比例1：5，抗冻剂二甲基亚砜在精子和稀释液的混合液中的终浓度为体积比8％。
7.根据权利要求4所述的对长江上游珍稀鱼类精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，保存胭脂鱼时，精液和冷冻保存液混合体积比为1：3，抗冻剂二甲基亚砜在精子和稀释液的混合液中的终浓度为体积比8％。
8.根据权利要求4所述的对长江上游珍稀鱼类精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，保存岩原鲤精子时，精液和冷冻保存液混合体积比为1：2，抗冻剂二甲基亚砜在精子和稀释液的混合液中的终浓度为体积比8％。
9.根据权利要求4所述的对长江上游珍稀鱼类精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，分装是在冰上进行，分装完毕后放在4℃预冷，分装和预冷的时间控制在25-30min。
...【技术特征摘要】
1.一种长江上游珍稀鱼类精子超低温冷冻保存液，其特征在于，所述保存液的成分为100ml保存液含有0.8～1.0g氯化钠，0.04～0.06g氯化钾，1.3～1.7g葡萄糖，7.2～15ml二甲基亚砜量，所述的长江上游珍稀鱼为胭脂鱼、岩原鲤和多鳞白甲鱼。
2.根据权利要求1所述的一种长江上游珍稀鱼类精子超低温冷冻保存液，其特征在于，所述保存液的成分为100ml保存液含有0.8g氯化钠，0.05g氯化钾，1.5g葡萄糖，抗冻剂为7.2～15ml二甲基亚砜，或者100ml保存液含有0.9g氯化钠，0.05g氯化钾，1.5g葡萄糖，抗冻剂为7.2～15ml二甲基亚砜。
3.一种多鳞白甲鱼精液的冷冻保存液，100ml所述的保存液含有0.9g氯化钠，0.05g氯化钾，1.5g葡萄糖，抗冻剂为7.2～15ml二甲基亚砜。
4.利用权利要求1或2所述保存液对长江上游珍稀鱼类精子超低温冷冻保存的方法，所述方法如下包括精子采集和检测、冷冻保存液配制、精子与冷冻保存液混合、分装和预冷、平衡与冷冻保存、解冻和检测；...
【专利技术属性】
技术研发人员：黎琳琳，丁小雨，刘阳，田永胜，李振通，王林娜，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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